发布时间 : 星期二 文章Bio-rad MicroPulser电穿孔仪中文说明书更新完毕开始阅读d712dc9cfd4ffe4733687e21af45b307e871f9ac
效率低103-104倍（Shigekawa and Dower, 1988, Simon and Ferretti, 1991）。在大多数物种中，每mol数量的质粒的电穿孔效率随着质粒大小的增加而降低，包括E. coli （Leonardo and Sedivy, 1990, Siguret et al., 1994），Pseudomonas aeruginosa（假单胞菌属）（Dennis and Sokol, 1995），和Streptococcus thermophilus（嗜热链球菌属）（Somkuti and Steinberg，1988）。但是，有些物种，包括Lactococcus lactis（乳球菌属）（Holo and Nes，1995），Enterococcus faecalis（肠球菌属）（Cruz-Rodz and Gilmore，1990）和Clostridium perfringens（产气荚膜梭菌）（Allen and Blaschek，1990），转化效率似乎与质粒大小（即使高达20-30Kb）无关。
尽管微生物的转化使用各种方法提取的质粒都可以完成，但质粒的纯度是影响转化效率的一个因素。未纯化的小量制备的质粒DNA的转化效率明显低于经过各种方法纯化的质粒DNA。利用Bio-Rad Quantum matrix制备的质粒与CsCl纯化质粒转化效率相当。
通常，对于所有种类的微生物，转化频率随着DNA浓度的增加而增加。对于E.coli，转化频率（转化子/活细胞）受DNA浓度影响的范围在106（10 pg/ml to 7.5 μg/ml），在这个范围内，DNA浓度决定了细胞被转化的概率。在较高的DNA浓度，高达80%的活细胞可被转化（Dower et al，1988）。因为获得的转化子的数量是转化频率和细胞数量的产物，转化效率（转化子/ug DNA）在109-3×1010细胞/ml范围内随细胞浓度增加而增加。因此，为了获得高的转化频率（transformation frequency），请使用高的DNA浓度。为了获得高的转化效率（transformation efficiency），请使用高的细胞浓度（和低的DNA浓度以防止共转化cotransformation）。在每个实例中，小的样本体积（20-50μl）允许经济地使用DNA和细胞（see Dower et al., 1988, for a detailed discussion of these factors）。
（3） 电穿孔介质（Electroporation Media）
MicroPulser被设计以使用具有高阻介质的样本。基于此，当制备感受态细胞时，洗涤以彻底去除培养基是非常重要的。若未彻底去除细胞中的培养基将导致电穿孔时在样本中产生电弧。细胞应该用水或低离子强度的溶液如蔗糖、甘油、葡萄糖、山梨醇或PEG洗涤至少3次。对许多微生物而言，甘油是一种方便的电穿孔介质，因甘油通常被用于细胞保存的冷冻保存液。
下图展示了几种不同生物学上的重要离子溶液对样品电阻的浓度效应。注意几点：
1 体积对样品的电阻有重要影响——对离子溶液，样品电阻和电转杯中样品的体积呈○
反比；
2 含有二价离子的溶液的电阻比含有相同浓度单价离子的溶液电阻低； ○
3 缓冲溶液的电阻受pH值影响。 ○
即使极低浓度的离子化合物的加入都可以显著降低样品的电导，进而引发电弧作用。通过乙醇沉淀法制备的DNA中残留的盐应该在用水或TE buffer溶解DNA前洗涤DNA以
降低盐浓度。
表1表明，虽然将含有10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0溶液的质粒加入水中，确实会降低样品的电导，但这应该不会导致不能使用MicroPulser进行电穿孔试验。可以直接使用酶反应的DNA进行转化，但进行高压脉冲操作时，最终电穿孔样品中的盐浓度应该保持在低于~5meq的水平。最后，连接混合物可能可以用于转化，但DNA加入量必须极低或者通过稀释（Willson and Gough，1988）、透析（Heery and Dunican，1989；Jacobs et al., 1990）或乙醇沉淀（B?ttger, 1988；Zabarovsky and Winberg，1990）降低离子强度。
3、 MicroPulser操作说明
参见图1了解MicroPulser的各个组件，图5标注了各个按钮和LED的名称。
3.1 设置MicroPulser系统
? 将黑色电源线连接到MicroPulser脉冲发生器模块的后面板。将电源线插入墙上
的插座或电源线。
? 拉下MicroPulser底部的折叠脚。将该脚插入电击腔底部的轨道中。将电击腔滑
块滑入电击腔。
? 将从电击腔引出的导线连接到MicroPulser前面板上的输出接口上；极性对电穿
孔过程并不重要。
? 打开电源开关。LED灯应亮起并且显示为“Ec1”，随后LED指示细菌设置状态
（Bacteria Setteing）。
3.2 MicroPulser的操作 （1）选择预设的程序
MicroPulser预设了数种常见的微生物的电击程序如下:
循环按“Settings”键选择“Bacteria”、“Fungi”和“Manual”。当“Fungi”旁的LED灯亮时，预存储的真菌转化程序即被调出。按“上”和“下”键可在不同的真菌转化程序间切换。电击的参数自动按显示的程序设定。同样的，选择“Bacteria”程序相同。
不管是选择“Bacteria”，还是“Fungi”程序，同时按住“上”“下”键可以在LED屏上显示选定程序的参数。显示屏上首先显示的是电压值，然后是“t”。如果一个程序的时间和多次脉冲相关，则显示“P”，然后显示“2”，表示将会进行两次连续的脉冲。如果没有给定“t”，则脉冲是非截短的（not truncated），而如果没有“P”被给定，则是单次脉冲。
（2）使用MicroPulser的手动模式
A. 改变电压
按“Settings”键，当“Manual”旁的LED灯亮时，显示屏显示电压值（单位kV）。按“上”和 \下\键在0.20 kV-3.00kV之间改变电压。如果仪器刚刚打开，显示值为“0.00”。
B. 截短脉冲.
当“Manual”旁的LED灯亮时，同时按“上”和 \下\键LED屏显示“t---”，表示为脉冲选择了时间。开机时的默认设置为标准的指数衰减脉冲，或衰减过程不被截短，显示为“--”。同时按“上”和 \下\键后只松开“下”键，显示数字为截短的脉冲持续时间，单位为毫秒，从1毫秒“t1.0”开始以0.1毫秒为增量一直到4毫秒“t4.0”。这将限定脉冲时间在1-4毫秒之间。同时按“上”和 \下\键后只松开“上”键，可以调整指定的脉冲截短时间到更短。 （3）脉冲功能
按“Pulse”键到电容充电至设定电压；显示屏上显示“PLS”。当脉冲完成后会发出一次响声，如果是一次设置好的多重脉冲则在整个脉冲过程中每次脉冲后均会发出一次响声，“PLS”则一直在显示屏上显示。要想手动进行多重脉冲，则可以在一次脉冲完成且响声停止后，再次按“Pulse”键。
如果发出比较低程度的响声，伴随着“Arc”在显示器上显示，则表明系统预防和淬灭（ARQ）系统被启动，脉冲被中止。这通常是电击杯被击穿的迹象，如果样品电阻太小，电击杯仍可能被击穿。因为在“ARQ”事件中释放的能量很低，重新设置一个不会产生电弧的参数对样品重新电击也可能会得到可接受的结果。但是，不建议使用经历了两次电弧事件的样品。 （4）测量
按“Measurements”键可以点亮\显示最后一次脉冲试验的实际电压（单位kV），如果仪器刚刚开机并且没有使用过，显示器显示\。再次按“Measurements”键可以点亮“Time ms”LED，显示上次脉冲持续时间。按住“测量”按钮，LED显示屏将在实际电压和时间常数之间切换。 3.3 使用MicroPulser进行电穿孔
? 将细胞悬液移入电转杯中，轻敲液体使之落入电转杯底部。0.2cm电转杯最多可
装0.4ml溶液，0.1cm电转杯最多可装80μl溶液。注意，温度会对转化频率产