发布时间 : 星期二 文章Bio-rad MicroPulser电穿孔仪中文说明书更新完毕开始阅读d712dc9cfd4ffe4733687e21af45b307e871f9ac
生重要影响。某些微生物的电转，包括E.coli和酿酒酵母，在冷的电转杯中转化效率更高。
? 将电转杯插入电击腔的滑槽中。将滑槽推入电击腔使电转杯与电击腔的电极紧密接
触。
? 按黄色“Pulse”按钮，给电容器充电并发出脉冲；LED显示屏将显示“PLS”，
直到一个声响结束表明脉冲已经给出。LED显示屏将显示程序，时间常数，或实际输出的电压，这取决于选择的LED。
? 从电击腔取出滑槽，并取出电击杯，处理电击好的样品细胞。
? 按下“测量”按钮，在显示屏LED上显示发送到样品的时间常数和实际电压。当
“Actual kV”旁的LED亮起时，电压显示为“kV”。再次按下“measurement”按钮即可显示时间常数。“Time ms”旁边的LED灯亮；时间常数以“ms”为单位。
? 按下电源按钮关闭仪器。如果需要，样品电击腔现在可以安全地断开。在导线断开
之前，不要拆卸电击腔盖。
4、 E.coli的高效电转化
E.coli电转化的转化效率可达109-1010转化子/μg，这比最好的化学转化法的转化效率都要高。下面的protocol描述了一种用于高效电转化的E.coli感受态细胞的制备方法。我们也对通过电穿孔转化的其他菌株感兴趣，并将此信息收录在我们的电转化手册的后续版本中。
4.1 制备电转化感受态细胞
参考Ausubel et al.（1987）、Miller和Nickoloff（1995）的文章获得更详细信息。 ? 向500ml LB培养基中按1%接种量接种新鲜的过夜E.coli菌液。
? 37℃、300rpm培养至OD600约为0.5-0.7（对数生长早期至中期收获的细胞
可获得最佳的转化结果，因此，适当的细胞密度取决于菌株和生长条件）。 ? 将菌液在冰上放置20min。随后的步骤中，尽可能保持细胞接近0℃（置于冰/水
浴中），在加入细胞之前，在冰上预冷所有的容器。转移细胞至预冷的离心管中，4℃、4000g离心15min。
? 小心倒去上清液。为了彻底去除培养基，宁可倒去部分细胞、牺牲收率。 ? 用500ml冰预冷的10%甘油溶液轻柔重悬细胞沉淀。4℃、4000g离心15min，
小心倒去上清液。
? 用250ml冰预冷的10%甘油溶液轻柔重悬细胞沉淀。4℃、4000g离心15min，
小心倒去上清液。
? 用20ml冰预冷的10%甘油溶液轻柔重悬细胞沉淀。转移至一个30ml无菌
Oakridge管中。4℃、4000g离心15min。小心倒去上清液。
? 用1-2ml冰预冷的10%甘油溶液轻柔重悬细胞沉淀。细胞浓度应在1-3×1010
cells/ml范围内。
本悬液可以冷冻在干冰或-70℃冰箱中，在该条件下，细胞可以稳定保存至少6个月。
4.2 电转化
? 冰上解冻感受态细胞。对将要电转的每个样品，预先准备一个1.5ml EP管和0.1
或0.2cm电转杯冰上预冷。
? 在预冷的1.5ml PP管内，混合40μl细胞悬液和1-2μl DNA（DNA应该为低离
子强度溶液，如TE）。混匀，冰上孵育1min。
注意：最好是在一个微量离心管中混合质粒和细胞，因电击杯的小槽不利于样品的均匀混合。
? 若选择0.1cm电击杯，请设置MicroPulser程序为“Ec1”，若选择0.2cm电
击杯，则选择程序“Ec2”或“Ec3”。具体仪器操作可见操作说明部分。 ? 转移DNA和细胞的混合物至预冷的电击杯中，轻弹悬液使其落入电击杯底部。将
电击杯放入电击腔滑槽。将滑槽推入电击腔，直至电击杯固定于电击腔的接触电极间。电击一次。
? 从电击腔中移出电击杯，立即加入1ml SOC培养基。用移液器迅速而轻柔地悬浮
细胞。电击后至将细胞转移至生长培养基的时间间隔对E.coli转化子恢复生长是非常关键的（Dower et al，1988）。这一过程即使只延迟1min，都会导致转化效率3倍的降低。延迟10min则降低20倍。
? 转移细胞悬液至17×100mm PP管，37℃、225rpm振荡培养1小时。 ? 检查和记录脉冲参数。时间常数应接近5ms。电场强度可以通过实际电压（kV）
/电击杯间隙宽度（cm）获得。 ? 在筛选平板上涂平板。 4.3 电转化所需溶液和试剂
? LB：10g Bacto tryptone，5g Bacto yeast extract，5g NaCl；溶于1L水，
高压灭菌。
? 10%（v/v）甘油：12.6g甘油（密度为1.26g/cc）于90ml水。高压或无菌过
滤。
? TE：10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA。
? SOC：2% Bacto tryptone，0.5% Bacto yeast extract，10mM NaCl，2.5mM
KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖。
5、 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisciae）的电转化 5.1 感受态细胞的制备
参考Becker & Guarantee（1991）和Ausubel et al.（1987）的文献获取更多信息。
? 用2.8L三角培养瓶装500ml YPD培养基，向其中接种0.1-0.5ml（原文为an
aliquot一小份，未规定具体接种量）过夜菌液。酿酒酵母在30℃条件下的的倍增时间大约为2小时。
? 30℃过夜培养，250rpm，至细胞密度为~1×108cells/ml（OD600=？）。 ? 于冰水浴中迅速冷却以停止生长。
? 将细胞倒入2个250ml离心瓶中，4℃、3000g离心5min。 ? 小心倒掉上清液。将有细胞沉淀的离心瓶置冰上。
? 向每个离心瓶中加入~50ml无菌、冰预冷的水，斡旋以重悬细胞沉淀。调整瓶内
液体的体积至250ml。4℃、3000g离心5min。倒去上清液。 ? 用250ml无菌、冰预冷的水按上一步骤重复洗涤细胞一次。
? 用20ml无菌、冰预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞，转移细胞悬液至一个预冷的
30ml Oakridge管。4℃、3000g离心5min。小心倒去上清液。
? 用0.5ml无菌、冰预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞沉淀。最终的细胞体积约1.3ml，
细胞浓度约1×1010cells/ml。将细胞置于冰上并尽快使用。
5.2 电转
? 吸取待转化的DNA样品（5-100ng/5μl）至一个1.5ml无菌EP管，置于冰上
预冷。
? 如果使用0.2cm电击杯，向每个DNA样品加入40μl感受态细胞；如果使用0.4cm
电击杯，则加入80μl感受态细胞。轻柔混匀，冰上孵育~5min。
? 若使用0.2cm电击杯，则设置MicroPulser程序为“Sc2”；若使用0.4cm电
击杯，则设置程序为“Sc4”。
? 转移DNA-细胞混合物样本至选定的且用冰预冷的电击杯中，轻弹电击杯使样本落
于电击杯底部。将电击杯放入电击腔滑槽。将滑槽推入电击腔直至电击杯固定于电击腔的接触电极间。电击一次。
? 从电击腔中移出电击杯，立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇。轻柔转移细胞悬液
至一个无菌管中。
? 检查和记录脉冲参数。时间常数应接近5ms。电场强度可以通过实际电压（kV）
/电击杯间隙宽度（cm）获得。
? 在含有1M山梨醇的筛选平板上涂平板。30℃培养48-72小时。 5.3 电转化所需溶液和试剂
? YPD：10g yeast extract，20g peptone，溶于900ml水，高压灭菌。使用前
加入100ml无菌葡萄糖。
? 1M山梨醇：182.2g山梨醇，溶于800ml水，定容至1L。高压灭菌。 ? 20%葡萄糖：20g葡萄糖，溶于60ml水。定容至100ml。0.22μm滤膜过滤除
菌。
6、 毕赤酵母（Pichia pastoris）的电转化 6.1 感受态细胞的制备
参考Cregg & Russell（1998）的文献获取更多信息。
? 用2.8L三角培养瓶装500ml YPD培养基，向其中接种0.1-0.5ml（原文为an
aliquot一小份，未规定具体接种量）过夜菌液。毕赤酵母在30℃条件下的的倍增时间大约为2小时。
? 30℃过夜培养，300rpm，至细胞密度为~5-7×107cells/ml（OD600=？）。 ? 将细胞倒入2个250ml无菌离心瓶中，4℃、3000g离心5min。 ? 小心倒掉上清液。
? 向每个离心瓶中加入~50ml无菌YPD/HEPES，斡旋以重悬细胞沉淀；加入
1.25ml 1M DTT至每个离心瓶中，轻柔混匀。30℃孵育15min。
? 用200ml无菌、冰预冷的1M山梨醇重悬细胞沉淀。4℃、3000g离心5min。
倒去上清。
? 用50ml无菌、冰预冷的1M山梨醇溶液斡旋重悬细胞，用无菌、冰预冷的1M山
梨醇调节溶液体积至250ml。4℃、3000g离心5min。倒去上清液。 ? 用10ml无菌、冰预冷的1M山梨醇重悬细胞，汇总转移细胞悬液至一个预冷的
30ml Oakridge管。4℃、3000g离心5min。小心倒去上清液。
? 用0.5ml无菌、冰预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞沉淀。最终的细胞体积约1.3ml，
细胞浓度约1×109cells/ml。将细胞置于冰上并尽快使用。
5.2 电转
? 吸取待转化的DNA样品（可多达10ug）至一个1.5ml无菌EP管，置于冰上预
冷。
? 加入40μl感受态细胞每个DNA样本，轻柔混匀。 ? 设置MicroPulser程序为“Pic”。
? 转移DNA-细胞混合物样本至冰预冷的0.2cm电击杯中，轻弹电击杯使样本落于
电击杯底部。将电击杯放入电击腔滑槽。将滑槽推入电击腔直至电击杯固定于电击腔的接触电极间。电击一次。
? 从电击腔中移出电击杯。当用营养缺陷突变株进行互补筛选时，立即加入1ml冰