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制备丁二酸相关方法
生物发酵法就是以淀粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、牛乳或其她微生物能够利用的废料为原料,利用细菌或其她微生物发酵的方法生产丁二酸及其衍生物(图3、3)。
丁二酸就是一些厌氧与兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物。一般情况下,丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌均能够分泌丁二酸。据报道,一些乳酸菌(LactobaciIlus)也能在特定的培养基上不同程度地产生丁二酸。国外在20世纪90年代就开始发酵生产丁二酸的研究,其中认为可接近工业化的发酵水平为产丁二酸浓度60 g·L-1以上,糖酸转化率0、8 g·g-1与生产效率1、5 g·(L·h)-1以上。目前有望成为丁二酸发酵工业生产的微生物菌株主要有:放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)工程菌、厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)、曼氏杆菌(Mannhei miasucciniciproducens)以及重组大肠杆菌(Escherichia coli)等(表3、1)与可再生原料如:乳清、糖类、小麦、菊芋粉及木质纤维素等。由于天然菌株产丁二酸的能力非常低,发酵产物多种多样,对糖或丁二酸的耐受性比较差,因此必须运用生物工程技术对现有的菌种进行改良重组。
图3、3 丁二酸生物法制备路线简图
3、3、1 乳清原料发酵生产丁二酸
乳清就是奶酪生产过程的副产物,每10 L牛奶可以得到1 kg 奶酪与9 L 乳清。乳清中含有3%~8%的乳糖,0、8%~1%的牛乳蛋白,1%的盐与0、1%~0、8%的乳酸。乳清可以液体、干乳清与乳清渗透物的形式作为发酵原料。
密西根大学的Samuelov等最先开始研究厌氧微生物发酵乳清乳糖生产丁二酸的能力,以A、 succiniciproducens ATCC29305为模式菌,用分批、连续与补料分批的方式直接发酵乳清生产富含丁二酸的动物饲料添加剂。在灭菌后的粗乳清中补加玉米浆、磷酸盐与镁盐作为培养基,其中乳糖的含量在44、7~48、7 g/L。A、 succiniciproducens在高CO2浓度的环境下培养,发酵液中丁二酸浓度最终达34、7 g/L,其中丁二酸与乙酸的比为4:1,乳糖的消耗率在90%以上,丁二酸对乳糖的产率大于80%,证实了由乳清原料生产丁二酸的可行性。
表3、1 国内发酵法制备丁二酸的主要研究进展
研究机构 研究进展 制备丁二酸相关方法
开展菌株选育与工艺研究,获得比较优良的产丁二酸放线杆菌菌株(Actinobacillus succinogenes CGMCC1593),利用制糖工业的副产物糖蜜为碳源,初始总糖浓度为 65g/L 时,产丁二酸放线杆菌厌氧发酵 48 h,丁二酸浓度可达55、2g/L,生产率 1、15g/(L?h) 底物 52g/L 葡萄糖发酵生产丁二酸达到 26、4g/L,转化率达到50、7% 江南大学 山东大学 木质纤维素水解液为碳源时分批培养的丁二酸最后浓度及得率分别为合肥工业大学 11、73g/L 与 56%,生产率为1、17g/(L·h);连续培养的丁二酸得率为 55% ,生产能力为3、19g/(L·h) 采用稀酸水解玉米籽皮制备混合糖液,脱毒脱色后,产丁二酸放线杆菌NJ113 培养基总糖浓度为50g/L 时,丁二酸分批发酵的质量收率可达南京工业大学 0、68g/g,浓度可达34、2g/L,生产强度达0、83g/(L·h),总糖浓度为68、2g/L 时,丁二酸质量收率仍可达0、62g/g,浓度为42、3g/L,生产强度为0、98g/(L·h) 进行好氧发酵研究,对丁二酸产生菌 S-1 进行紫外线与亚硝基胍的复合诱变后,筛选出丁二酸产量高、遗传性状稳定的菌株S-57,并对其进行激光诱变,筛选出菌株 SH-24,丁二酸产量达到 21、25g/L。经鉴定该菌为总状枝毛霉Mucor racemosus Fresenius)SH-24 烟台大学 韩国Lee等报道了A、 succiniciproducens ATCC29305与M、 succiniciproducens MBEL55E分批、连续发酵乳清生产丁二酸的情况。在基础盐与乳清组成的培养基上,A、 succiniciproducens ATCC29305菌体不生长,但在补加酵母膏与聚蛋白胨的乳清培养基中,菌体生长与产酸。当葡萄糖与乳清作为混合底物时(20 g/L乳清与7 g/L葡萄糖),丁二酸产率与生产强度分别为95% 与0、46 g /(L· h),丁二酸浓度达15、5 g/L,比单以乳清为底物时的生产强度高出近一倍。在最佳的稀释速率下连续发酵,丁二酸的生产强度达到1、35 g/(L· h),并且发酵液中,丁二酸与乙酸比值提高到5、1:1~5、8:1。用玉米浆代替乳清培养基中的酵母膏,M、 succiniciproducens MBEL55E分批发酵乳清原料产丁二酸13、0 g/L,丁二酸产率与生产强度为71%与1、18 g/(L· h)。以稀释速率为0、6h-1 连续厌氧发酵时,丁二酸产率63%~69%,生产强度达到3、9 g/(L· h),比分批培养提高了3、3倍。结果表明了用廉价的乳清与玉米浆为原料可以有效的生产丁二酸。最近 Wan等研究用Actinobacillu ssuccinogenes 130z发酵奶酪乳清也能生产丁二酸。50 g/L奶酪乳清的培养基,丁二酸的产率57 %,生产强度0、44 g/(L· h),乙酸与甲酸为主要副产物。
3、3、2 糖类原料发酵生产丁二酸
含有由葡萄糖与果糖组成的二糖植物通常称为糖料植物,甜菜与甘蔗就是蔗糖与糖蜜的主要来源,甜高粱也可作为蔗糖的来源。
糖蜜就是制糖工业的副产品,糖蜜一般含有大约40%~50%(质量分数)总糖(主要成分就是
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蔗糖、葡萄糖与果糖),就是发酵工业中较廉价的碳源原料。糖蜜除了比葡萄糖价格低廉外,还含有多种微生物生长所需要的营养素如维生素,氨基酸与矿物质等,就是一种理想的发酵生产丁二酸的原料。印度Agarwal等报道从牛瘤胃中分离获得的产琥珀酸E、 Coli,在优化后的含甘蔗糖蜜与玉米浆的培养基中,其丁二酸的产量比用葡萄糖与蛋白胨培养基的产酸提高了9倍。在10L发酵罐中,初始甘蔗糖蜜总糖浓度50 g/L,36 h生成17 g/L丁二酸,丁二酸的产率与生产强度分别为34%与0、5 g/(L·h)。刘宇鹏等研究用A、 succinogenesCGMCC1593发酵甘蔗糖蜜生产丁二酸,工业废糖蜜经酸预处理后作为培养基的碳源,培养液中总糖浓度为64、4 g /L,其中含44、9 g /L蔗糖,9、8 g /L葡萄糖,7、2 g /L 果糖,分批发酵48 h产丁二酸46、4 g/L,丁二酸产率79、5%。在5 L发酵罐中进行补料分批发酵,丁二酸浓度可达到55、2 g/L。董晋军等研究了用甘蔗糖蜜原料半连续发酵生产丁二酸工艺,采用两级双流式半连续发酵操作,39个批次(一级罐连续时间269 h), 二级发酵罐平均产酸43、5 g/L,平均生产强度达到2、07 g /(L·h),较相同有效装液量的分批发酵或补料分批发酵单位时间产发酵液体积提高2~3倍。甜高粱就是一种新型绿色可再生高能作物,平均含糖量7%~15%,其茎秆中富含50%~70%糖汁,茎汁中的糖分以蔗糖为主(最高占79%),其次就是葡萄糖与果糖,茎汁中还含有N、Mg、Ca元素。因此也可以作为发酵的碳源。
表3、2 5 L发酵罐中甜高粱榨汁糖浆补料分批发酵生产丁二酸情况
发酵时间/h 丁二酸/(g/L) 0 8 16 24 32 40 44 48 0、00 6、05 23、05 30、38 39、69 54、09 58、85 59、80 甲酸/(g/L) 0、77 2、63 3、79 3、50 1、01 0 0 0 乙酸/(g/L) 0、21 2、62 4、63 4、42 4、46 4、23 4、89 4、86 残糖/(g/L) 39、55 25、63 20、11 23、25 22、98 12、56 8、21 7、50 江南大学郑璞课题组采用收割后的甜高粱秆榨汁,榨汁液进行发酵产丁二酸试验,得到较好的结果(表3、2)。榨汁液发酵培养基中以玉米浆为氮源,初始还原糖浓度60、5 g/L,在5 L发酵罐中,A、 succinogenes CGMCC 1593分批发酵48h,产丁二酸47、2 g/L。补料分批发酵时,通过补加甜高粱榨汁糖浓缩液,控制发酵液中的糖浓度在20~30 g/L。发酵48 h,总投入甜高粱
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榨汁糖浆糖浓度为80、4 g/L(按最终体积计),发酵剩余还原糖浓度为7、5 g/L,产丁二酸浓度59、8 g/L,较分批发酵提高了21%,生产强度1、25 g/(L· h)。试验结果表明有良好应用前景。 3、3、3 小麦水解发酵生产丁二酸
谷类植物就是淀粉的主要来源,杜晨宇等进行了以小麦为原料发酵丁二酸的研究。整个过程分两个阶段,第一阶段运用真菌将小麦淀粉转化为发酵原料,第二阶段用A、 succinogenea ATCC55618发酵产丁二酸。
一种方法就是将泡盛曲霉Aspergillus awamori 2B、163在含8%小麦粉的培养基中液体发酵96 h,发酵滤液(含30 g/L的葡萄糖与100 mg/L的氨基氮)用于A、 succinogenea发酵,产丁二酸5 g/L,副产物乳酸2、9 g/L,丁二酸对小麦粉产率为0、063 g/g。另一种方法,用富含葡萄糖淀粉酶的Asp、 awamori发酵滤液,水解面粉产生葡萄糖富集液,将Asp、awamori 发酵滤渣中的菌丝体自溶,制成氨基氮富集液,两者混合成含葡萄糖45 g/L,氨基氮500 mg/L的培养基,经A、 succinogenea发酵可产生16 g/L丁二酸,副产物8 g/L乙酸与6 g/L甲酸,丁二酸对小麦粉的产率为0、19g/g。另外在第一阶段中,改用双菌固体发酵产酶,将泡盛曲霉 Asp、 awamori 与米曲霉Asp、 oryzae分别在小麦麸皮培养基中固体发酵产淀粉酶与蛋白酶,然后分别用提取的酶液水解小麦粉与面筋蛋白,制备含葡萄糖浓度140 g/L以上的糖富集液,与含3、5 g/L以上游离氨基氮的富集液。两种富集液混合作为A、 succinogenea ATCC55618发酵的原料,发酵过程添加MgCO3,丁二酸浓度达到64 g/L。说明小麦可作为发酵丁二酸的一种有效原料。 3、3、4 菊芋粉发酵生产丁二酸
菊芋就是多年生块茎植物,菊芋块根成分中除水分外,含有大量菊糖,可达干重的70%~80%,菊糖就是以b-1, 2键连接的末端有一个蔗糖基的多聚果糖,使聚合度为32~34的多糖。菊糖水解后得到果糖与葡萄糖,不需提纯可直接用于发酵。因此,也就是发酵工业上一种较廉价的碳源。
江南大学郑璞课题组研究了菊芋为原料A、succinogenesCGMCC1593发酵生产丁二酸。黑曲霉Asp、 niger SL-09发酵产菊粉酶,酶活达到46 U/mL发酵液。该发酵液在50℃条件下按10%加量与菊芋粉作用,水解得到菊芋糖浆。A、 succinogenes CGMCC 1593在含还原糖浓度为53、5 g/L的菊芋糖浆发酵培养基中发酵36 h,产丁二酸43、5 g/L,生产强度1、22 g/(L·h)。另一方面初步研究了菊芋同步糖化发酵工艺。菊芋粉为培养基碳源,玉米浆为氮源,按每克底物加入40U菊粉酶的比例加入Asp、 niger SL-09培养液,60℃保温10 min后,降温到37 ℃,接入A、 succinogenes SF-9进行同步糖化发酵,发酵72 h。产丁二酸59 g/L,在此基础上采用补料发酵,发酵过程总投入约菊芋粉192 g/L(总计还原糖134 g/L),发酵96 h,丁二酸浓度98 g/L,表明同