发布时间 : 星期日 文章发酵工程综合实验报告 - 图文更新完毕开始阅读dc6f1ca9a8956bec0875e387
原剂的化学反应不同。蛋白酶的作用不是破坏二硫键，而是断开形成面筋的三维网状结构。蛋白酶在面包生产中的作用主要表现在面团发酵过程中。由于蛋白酶的作用，使面粉中的蛋白质降解为肽、氨基酸，以供给酵母碳源，促进发酵。 随着蛋白酶制剂应用研究的不断深入，人们逐渐发现了蛋白酶在动物营养上的独特作用，蛋白酶也因此受到了越来越多的关注
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。但目前无论是对蛋白酶
的基础研究还是应用研究都还存在很多不足，需要加强以下方面的工作：①筛选和培育产蛋白酶含量高的微生物菌种，并且这些菌所产的蛋白酶必须稳定性好，适合在饲料工业中应用；②研究不同pH值特性的蛋白酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶）在动物消化道内的相互作用；③研制具有多种用途（如既可补充动物内源酶不足又可降解抗营养因子）的复合蛋白酶；④根据不同的日粮类型和动物生长阶段，开发专用的蛋白酶产品；⑤加强蛋白酶在生长和成年动物上的应用研究；⑥研究蛋白酶对动物内源酶和饲料中其它外源酶的影响【5】。
本次实验目的在于学习蛋白酶的定性定量测定方法，考察营养及环境对酶生产的影响，以及熟悉小型发酵罐的使用。最终确定最佳装液量条件为60ml。在此基础上，我们进一步确定了最适温度为40℃，最适pH=5。此次试验能够帮助我们了解蛋白酶的性质，确定酶的最适条件，熟悉小型发酵罐的操作工艺流程。
2.材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
2.1.2 试剂
（1）生理盐水：称取0.85gNaCl，用蒸馏水定容至100ml，即为0.85%生理盐水, 121℃灭菌20min。
（2）福林试剂(Folin试剂):使用时加2倍蒸馏水稀释,即成已稀释的福林试剂。 （3）0.4mol/L碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠42.4g，用蒸馏水定容至1000mL。 （4）0.4mol/L三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸65.4g，用蒸馏水定容至1000mL。
（5）pH 7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO422H2O)31.2g，用蒸馏水定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4212H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。
取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol /L pH 7.2的磷酸
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盐缓冲液。
（6）2%酪蛋白溶液: 准确称取干酪素2g, 称准至0.002g，加入0.1mol/L氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH 7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
（7）100μg/mL酪氨酸溶液: 精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g, 逐
步加入6mL 1mol/L盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以0.21mol/L盐酸定容至100mL, 即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。 （8）蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。
（9） 标准葡萄糖溶液（0.1mg/mL）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。
2.1.3 培养基
（1）牛肉膏蛋白胨培养基（g/100ml）：牛肉膏0.5，蛋白胨1，氯化钠0.5，pH 7.0-7.2 ，121℃灭菌20min 。
（2）酪蛋白培养基（g/100ml）：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，氯化钠0.5, 奶粉5，琼脂2， pH 7.2-7.4，121℃灭菌20min 。 （3）细菌种子培养基1: 牛肉膏蛋白胨培养基。
（4）细菌基本液体发酵培养基（g/100ml）：豆饼粉3.0，玉米粉4.0，麸皮粉2.5，磷酸氢二钠0.4，磷酸二氢钾 0.03，pH 7.2-7.4，121℃灭菌20min 。 （5）PDA酪蛋白培养基（100ml）：马铃薯汁（20%）100ml，奶粉5g，琼脂粉2g，自然pH，121℃灭菌20min。
2.1.4 实验仪器
试管，烧杯，移液管，锥形瓶，胶头滴管，100ml容量瓶，移液枪，恒温振荡箱，恒温培养箱，培养皿，水浴锅，分光光度计，离心机，离心管，比色皿等。
2.2 方法
2.2.1 蛋白酶酶活测定（福林-酚法）
原理：福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为
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底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
酪氨酸标准曲线的绘制： 取6支干燥试管编号，分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色20min在用721型分光光度计进行测定(波长660nm)。
表1 酪氨酸标准曲线绘制加样
编号 酪氨酸/ml H2O/ml Na2CO3/ml 福林-酚/ml 1 0 1.0 5 1 2 0.2 0.8 5 1 3 0.4 0.6 5 1 4 0.6 0.4 5 1 5 0.8 0.2 5 1 6 1.0 0 5 1 OD660
蛋白酶活力测定：试管中加入0.1M pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液稀释后的酶液1ml（或固体物料1g，加水9ml振荡30min后取1ml），取，40℃预热5分钟，加入预热过的pH 7.2的2.0%酪蛋白1ml, 摇匀，在40℃水浴中准确反应10分钟。用2ml T C A终止酶反应，静置10 min。过滤后取1ml滤液，加入0.4mol/L碳酸钠5mL,再加入已稀释的福林试剂1mL。空白试验测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活,再加入酪蛋白。（若OD值过大，可稀释滤液重新比色，不允许稀释显色液）
蛋白酶酶活力单位的定义：在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。蛋白酶活力（μ/ml）=A*4*N/10；式中:A——由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；N——酶液稀释的倍数;10——反应10min。
2.2.2 总可溶性糖测定
原理：蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。 葡萄糖标准曲线测定：取7支干燥洁净的试管，按表2顺序加入试剂，进行测定。以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线。
表2 葡萄糖标准曲线绘制加样 单位：ml
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管号 标准葡萄糖溶液 蒸馏水 蒽酮试剂 葡萄糖浓度（mg/ml） A620nm 0 0 1.0 1 0.1 0.9 2 0.2 0.8 3 0.3 0.7 置冰水浴中5min 4 0.4 0.6 5 0.6 0.4 6 0.8 0.2 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色
发酵液中总糖测定：取稀释后的发酵液1mL，加入蒽酮试剂4mL（注意冰浴），加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。空白试验中将稀释样液换为水，其它测定方法同上。
2.2.3 枯草芽孢杆菌发酵实验
（1）种子培养：在无菌条件下自斜面菌种挑取一环菌体，接入装有30毫升种子培养基的250ml三角瓶中，在30±1℃振荡培养12-16h。
（2）涂平板：取种子培养液1ml, 用无菌生理盐水稀释度，取10-5，10-6稀释度，涂布在酪蛋白培养基平板上。每个稀释度涂2套平板，每套平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃涂棒均匀地涂满整个平板表面。
（3）发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中，振荡培养72h。
（4）蛋白酶摇瓶发酵工艺优化：改变发酵的某一条件，如 碳源种类，氮源种类，C/N, pH, 装液量等，测定蛋白酶酶活，以确定较优的发酵工艺条件。
（4）提取（液体培养）：将培养物合并，抽滤除菌体，测定滤液的蛋白酶酶活，算出总酶活。向滤液加入硫酸铵使浓度达55%，静置过夜，去上清液，将沉淀通过压滤除母液，（测定母液中的蛋白酶活性），于40℃干燥24h,烘干后进行磨粉，即得粗酶制品。测定粗酶制品中的蛋白酶酶活。
2.2.4 发酵罐实验
（1）种子培养：在无菌条件下自斜面菌种挑取一环菌体，接入装有50毫升种子培养基的500ml三角瓶中，在30±1℃振荡培养16-18h。
（2）接种： 将浸有酒精的脱脂棉围绕在接种口周围，点火后打开接种口，将种子培养液注入。接种量为1%-5%，盖好接种口，调节搅拌转速至所需数值，培养开始。
（3）取样：为了解培养过程中的变化，需定时取样进行样品分析。由于罐内为正压，打开取样管时，样品自然流出。取样时应将上一次取样时残留在取样管中的培养液去除后再取样。另外，取样后应通过加热蒸汽，以防取样管路污染杂菌。 （4）培养结束：将电极与培养液全部取出，发酵罐冲洗干净。
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