发布时间 : 星期六 文章关于植物组培的本科论文 - 图文更新完毕开始阅读dc80f4cdb8d528ea81c758f5f61fb7360a4c2b45
移液枪将混合液加到样品槽中，每孔5μl。
(5)开始电泳，大约1小时结束。
(6)取出凝胶，置于凝胶成像仪上观察、照相。
3 实验结果与分析
3.1 油菜遗传转化体系
如下图1为油菜遗传转化过程各主要阶段的状态特征。
首先将种子铺在M0培养基上，即进行种子的萌发培养，期间多观察种子发芽率，待幼苗生长至一定阶段进行摇菌，大约六天过后，开始进行下胚轴的切取及农杆菌侵染，侵染沥干之后放入M1培养基（不加抗生素）进行下胚轴和农杆菌的共培，两天后转入M2培养基，诱导愈伤组织，三周后对下胚轴进行继代培养，转入M3培养基中，进行愈伤组织的再分化， 每两周继代一次，直至在M3培养基中生长出分化芽，切取芽点，放入M4培养基中进行生根培养，一个月后，将即有叶子又有根的外植体移入小花钵中炼苗。
图1 甘蓝型油菜遗传转化的不同时期
加图注，可以吧每张图命名如图1a：种子在MS培养基上发芽,图1b：。。。。
Fig 1 Different periods of genetic transformation of B.napus
3.2 抗性苗PCR检测结果
本实验“湘油15号”甘蓝型油菜共得到119株抗性苗，取抗性苗的叶片，用CTAB法提取DNA，并进行PCR检测和凝胶电泳，凝胶成像仪上观察、照相。如图2所示，以
pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09质粒为阳性对照，湘油15号DNA为阴性对照， 2-8号泳道的PCR
产物和阳性对照大小一致，表明这些植株是抗性苗，成功转入了pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09
9
质粒，这些抗性苗中具体有多少是真正的转基因植株还需要进一步观察检测。
图2抗性苗PCR检测结果
Fig 2 PCR detection of resistant seedlings
注：M：DL500 ；1-8：抗性苗；+：阳性对照，—：XY15阴性对照。
Note: M: 100bp plus Ladder DNA ; 2-8 :PCR results of Transformed Brassica Napus DNA ;+: positive control;
—: negative control.
3.3 油菜遗传转化效率统计
本实验得到的外植体、抗性苗和转基因植株的数量如表3，但由于本实验实验数据不够庞大，实验结果存在偶然性。
表5 外植体的转化效率
Table 5 Transformation efficiency of explants
甘蓝型油菜品种
外植体总数
抗性苗
转基因植株
转化率（%）
湘油15号 约2000 119 1 0.05
4 结论与讨论
近年来，油菜转基因研究发展迅速，利用转基因技术已经得到多种品质优良的转基因材料。农杆菌介导法因其优点较多而成为目前最常用的转化方法，但目前油菜转化效率较低，阻碍了油菜育种上转基因技术的普遍使用。本实验的油菜转化率低，仅0.05%，除去本人实验操作经验不足以及甘蓝型油菜本身为异源四倍体很难转化之外，还有很多因素的影响，比如抗生素，抗生素的主要作用是抑制农杆菌的过度生长，避免农杆菌的过度生长而影响外植体的生长，抗生素种类的选择与浓度的大小对转化频率均有影响，在油菜的遗传转化过程中,常用的抗生素有羧苄青霉素、头孢霉素等。本实验所用抗生素为羧苄青霉
10
素,但研究表明,Cb对下胚轴外植体的芽分化具有很大抑制作用[29],由于本人在试验中外植体上的农杆菌容易抑制不住,会出现农杆菌大量生长的现象,这也导致影响了整个实验的进程。此外，农杆菌侵染外植体的浓度和时间也是影响遗传转化的重要因素，浓度过高，时间过短，受体材料可能未被充分感染，造成转化率低；浓度太低，时间过长，又会使受体材料侵染过度褐化甚至死亡。本人实验经验不足，在农杆菌的浓度上把握不好，容易出现差错。此外，在实验过程中发现，有些抗性植株在成苗初期PCR检测呈阳性，但培养一段时间后，检测呈阴性，出现假阳性的情况，可能的解释有前期农杆菌液处理外植体时浓度过高或者时间过长，导致外植体直至分化成苗还残留含有目标质粒的农杆菌。为避免出现假阳性的情况，对于检测呈阳性的植株，以后应该多次检测，且尽量选取新生叶片进行PCR检测。以上的这些情况都会导致油菜转化的效率低下，针对这些问题，科研工作者们也正在摸索解决之道，比如在培养基中加入适当浓度的AgNO3或者植酸（PA），能够有效缓解外植体褐化的现象[30]，避免外植体因为乙烯积累过量死亡；在生根培养基中加入适当吲哚丁酸（IBA）促进分化苗生根，缩短生根培养的时间。
参考文献
[1] 梁会娟,曹刚强,苗利娟等. 根癌农杆菌介导的fad2 RNA干扰体基因转化甘蓝型油菜的研究[J]. 河南
农业科学,2007,(01):34-38.
[2] 黄林纳. 我国主要油料作物及植物油的起源与发展史[J]. 信阳农业高等专科学校学
报,2009,(04):127-129.
[3] 沈金雄,傅廷栋,涂金星,马朝芝. 中国油菜生产及遗传改良潜力与油菜生物柴油发展前景[J]. 华中农业大学学报,2007,(06):894-899.
[4] 娄正,刘清,师建芳等. 我国主要油料作物加工现状[J]. 粮油加工(电子版),2015,(02):28-34+38. [5] 李春顺,陈利萍,张明方. 十字花科作物转基因研究进展[J]. 细胞生物学杂志,2003,(06):353-357. [6] 巩健,张源,杜立国. 根癌农杆菌介导的芥菜型油菜高效遗传转化[J]. 四川农业大学学
报,2013,(04):377-380.
[7] 吴丽芳,李红,宋道君等. 建立低能离子束介导小麦转基因方法并获得转GUS基因植 株[J]. 遗传学
报,2000,11:982-991.
[8] 钟鸣,黄国涛,白丽萍等. 基于农杆菌介导法的植物转基因载体的改造[J]. 华北农学
报,2011,01:41-46.
11
[9] 王全伟,张海玲,白晶等. 农杆菌介导的大豆植株整体转化[J]. 大豆科学,2008,02:190-193+198. [10] 汤敏,官春云,刘忠松. 油菜遗传转化体系研究进展[J]. 作物研究,2012,(03):295-298+313. [11] 廖志强,邬贤梦,孙娟,官春云. 甘蓝型油菜下胚轴一步不定芽再生培养及遗传转化应用[J]. 分子植物育种,2015,(04):793-799.
[12] 李金环,寿佳,吴强. CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用[J]. 遗传,2015,(10):992-1002.
[13] GRISSA I，VERGNAUD G，POURCEL C. The CRISPRdb databaseband tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats [J].BMC Bioinformatics，2007，8(1)：172
[14] Makarova KS, Haft DH, Barrangou R, Brouns SJ,Charpentier E, Horvath P, Moineau S, Mojica FJ, Wolf YI,Yakunin AF, van der Oost J, Koonin EV. Evolutionand classification of the CRISPR-Cas systems. Nat RevMicrobiol, 2011, 9(6): 467–477.
[15] Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The newfrontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.Science, 2014, 346(6213): 1258096.
[16] 景润春,卢洪. CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展与在作物遗传育种中的应用[J]. 中国农业科学,2016,(07):1219-1229.
[17] Nishimasu H，R an F A，Hsu P D，et al． ． Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA [J]． Cell，2014，156( 5) : 935 － 949．
[18] 郑小梅,张晓立,于建东,郑平,孙际宾. CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的研究进展[J]. 生物技术进展,2015,(01):1-9+78-79.
[19] 赵海卫,吕欣,尹文. CRISPR/Cas9系统——靶向基因组编辑的新策略[J]. 中国病原生物学杂志,2015,(03):281-284.
[20] 郑武,谷峰. CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J]. 遗传,2015,(10):1003-1010.
[21]刘志国. CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J]. 畜牧兽医学报,2014,(10):1567-1583. [22] 李茂,字学娟,蒋昌顺. 抑制消减杂交在热带作物研究中的应用[J]. 亚热带农业研究,2008,02:151-153.
[23] 任志莹,杨立国,肖军等. 植物基因分离的抑制消减杂交PCR[J]. 辽宁农业科学,2008,01:41-43. [24] 孟庆峰,刘琪,王伟利. 抑制消减杂交技术(SSH)及其在兽医领域的应用[J]. 黑龙江畜牧兽医,2013,(23):23-26.
[25]田连福,郭新红,姜孝成等. 抑制消减杂交技术(SSH)及其在植物基因克隆上的应用[J]. 生物学杂志,2002,04:29-30+40.
[26]彭琦.与甘蓝型油菜脂肪酸组分形成相关新基因的克隆.湖南农业大学,2011.
[27]李荣华，夏岩石，刘顺枝等. 改进的CTAB提取植物DNA方法[J].实验室研究与探索，2009.
12
[28]陶生策，张治平，张先恩.PCR技术研究进展[J].生物工程进展，2001，21(4): 26-29.
[29] 石淑稳,周永明.甘蓝型油菜下胚轴培养和高频率芽再生技术的研究.中囯油料作物学报,1998,20(2):1-6.
[30] 于守超，赵兰勇，王芬等.植物组织培养过程中外植体褐变机理研究进展[J].山东林业科技，2004(5):61-3.
13