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脂肪酶工业应用与改造研究进展
脂肪酶工业应用与改造研究进展
内容摘要:
脂肪酶(LipaseEC3．1．1．3甘油水解酶)是一类特殊的酰基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。 脂肪酶广泛存在于动植物与微生物当中。由于微生物脂肪酶具有种类多、比动物脂肪酶具有更广的作用pH和作用温度范围、便于进行工业生产和获取高纯度制剂等优点而得到广泛应用，特别是在油脂化工和有机合成工业中，酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点。因此微生物脂肪酶已经成为生产脂肪酶的主要来源，关于微生物脂肪酶在工业上的生产也越来越多。
关键词：脂肪酶，分子改造，定向进化，应用
一、脂肪酶简介
脂肪酶( Lipase, EC3. 1. 1. 3,甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶[1]，在动植物体和微生物中普遍存在。1834 年兔胰脂肪酶活性的报
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道至如今的微生物脂肪酶已有上百年的历史。微生物发酵法的应用前景要远远大于提取法及化学合成法。我国60 年代也已开展脂肪酶的研究开发[2]。脂肪酶不仅可以进行酯化,转酯 酯交换及合成等反应，在食品品质改良催化药物皮革生产可生物降解的无污染洗涤剂的研发和生物柴油的生产等方面脂肪酶更是有着不可替代的作用和应用潜质[3]。
二、应用脂肪酶时存在的问题
脂肪酶的来源非常广泛,普遍地存在于动物植物和微生物中。工业用脂肪酶多来源于微生物。目前工业和实验室中使用的菌株多是通过在自然界中筛选得到高产的菌株然后进行定向和非定向改造得到高性能的突变株。 脂肪酶是工业应用中十分广泛的一个酶类,尤其是在化工或者生物柴油制备过程中有着广泛和巨大的作用,但是脂肪酶作为一种蛋白质极易变性和失活。如在生物柴油的生产过程中和废纸脱墨或者是在生产天然黄油的过程中,通常是在有机溶剂中或者在极度酸碱的环境下起作用,这些苛刻的环境极大的限制了脂肪酶的使用的范围和作用的效力。不仅如此在这些条件下使用极度容易使脂肪酶失活,导致了生产的成本大幅度的升高,从而限制了脂肪酶在工业中的广泛大规模的使用。
然而目前解决这种问题主要有两条途径：第一是从一些极端的环境下如在北极或者盐碱地筛选有特殊耐受性的脂肪酶，但是这样筛选成本很高，并且不一定能筛选到我们工业上所需要的特性如稳定性，手性，底物选择性很强的脂肪酶。第二条途径：随着越来越多的脂肪
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酶的晶体被解析，酶的3D结构对我们而言不再是像以前那样神秘了，现在越来越多的研究人员尝试通过人为的改造脂肪酶的结构或者对脂肪酶分子进行定向修饰改造来获得需要的脂肪酶。 三、脂肪酶化学修饰
脂肪酶的化学修饰跟其他的酶的修饰一样，就是利用化学手段将一些化学物质或者结合到酶分子上，或者将酶进行重组删减，改变酶的性质，最终改变酶的催化性质的目的。常见的化学修饰分为小分子修饰，单功能聚合物的化学修饰，以及多糖等的修饰。 3.1双功能聚合物的化学修饰
所谓双功能聚合物就是指一些有两个功能区域的聚合物如戊二醛等。把戊二醛将脂肪酶蛋白分子间，亚基之间或分子内部各个肽链之间交联形成交联酶晶体，从而大幅度提高酶稳定性。 3.2 PEG聚和物修饰
聚乙二醇或甲基聚乙二醇， PEG有一系列不同分子量分布的产品, 无毒副作用,无免疫原性,具有良好的生物相容性。人们利用PEG 化技术先后对大量的蛋白和酶制剂进行了修饰, PEG化的药物能大大延长其在体内的半衰期,进而延长药物的作用时间、减少服药次数。PEG必须经过火化才能利用与脂肪酶的修饰作用。采用三聚氯氰活化技术,将PEG 共价偶联到不同的脂肪酶制备出具有双亲的性质的改性脂肪酶,获得的新型的脂肪酶具有许多的新型的活性和特性，这种酶既保持了原有的性质也实现了快速分离。 3.3小分子修饰
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在脂肪酶表面的赖氨酸末端的氨基有特别强的亲核性，能与许多亲电试剂发生反应这对于保持酶的活性和酶活损失很有帮助，赖氨酸的游离氨基成为脂肪酶表面修饰的首选基团。在70年代Means 和 Feeney报道了利用乙醛和丙酮与氨基形成西夫式碱对蛋白质进行了修饰。Kaimal 和Saroja采用类似的方法,用丁醛、异丁醛和丙酮对猪胰脂酶进行了化学修饰,结果发现修饰后脂肪酶的 Vma x提高了50% ,催化水解和酯化的活性都有所提高, 而酶原有 1, 3专一性未受影响。
四、脂肪酶的分子进化
分子进化是在分子水平上利用基因工程手段对脂肪酶进行有针对的改造和定向加工，来创造出具有新功能的酶。分子进化的手段大致有：理性设计，定向进化及一些突变技术。分子进化在提高微生物脂肪酶稳定性取得了巨大的成功。 4.1理性设计
理性设计是根据已知脂肪酶的三维结构,利用生物信息学 (如动力学模拟)分析脂肪酶蛋白分子结构和功能的关系,确定可以替换或修饰的氨基酸残基、 替换氨基酸残基的类型、 侧链修饰对脂肪酶催化性能的影响,然后运用定点突变技术完成氨基酸残基的替换。Magnusson利用分子动力学模拟技术结合定点突变技术,将 C. antarctica脂肪酶 B活性中心的色氨酸残基突变为丙氨酸残基,有效地扩大了脂肪酶活性中心的空间,对仲醇的催化活性提高了 270倍。
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