发布时间 : 星期六 文章生物物质分离工程实验(10级版本).更新完毕开始阅读e680f5382379168884868762caaedd3383c4b52a
实验十、十一 苹果中多酚类物质的分离提取及其定量检测
（第五次实验）-----设计性实验
一、实验目的
1、了解苹果多酚类物质的性质及作用 2、熟悉苹果多酚的提取及鉴定方法
二、实验原理
性质：苹果多酚粉末呈黄褐色或淡褐色，其水溶液呈黄褐色，有微弱的苦味和涩味。多酚类物质易溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂，苹果多酚同时还具有优良的耐热性和耐酸性，在pH在2～10、温度为100℃条件下，苹果多酚的分解率很低，易于保存。
提取：多酚类物质在乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂中都有较高的溶解度，综合考虑试剂毒性及成本等，最常用的方法是用乙醇作为溶剂浸提。有机溶剂法具有设备简单、操作方便和成本低廉等优点，（最佳提取工艺为: 乙醇浓度60%，提取时间为120min，温度为60℃，料液比1∶6，提取一次,最大提取率为3.80mg /g）
测定：过量酒石酸铁在多酚溶液中与多酚反应生成稳定的紫褐色络合物（可作鉴定），溶液颜色的深浅与溶液中多酚的含量成正比。因此可通过比色法540nm定量测定多酚,用没食子酸制作标准曲线，多酚含量在5～30μg范围内与吸光值呈良好的线性关系。
三、实验器材和试剂
试剂：酒石酸钾钠（C4H4O6NaK·4H2O），硫酸亚铁（FeSO4·7H2O），磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），
磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O），没食子酸，维生素c，成熟苹果一个，60%乙醇。 酒石酸铁溶液：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）1g 和含4个结晶水的酒石酸钾钠（C4H4O6NaK·4H2O）5g, 混合后加蒸馏水溶解，定容到1000mL。（根据实际用多少来决定，不一定要配那么多）
pH 值7.5 的磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）60.2g 和磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）5.00g，混合后加蒸馏水溶解，定容到1000mL。
没食子酸标准溶液的配制：称取没食子酸0.5g溶于10ml去离子水中，用1000ml 容量瓶定容，
0.5 mg/ml
器材：分析天平，可见光分光光度计，1000ml容量瓶3个，试管10只，烧杯，滴管，三角瓶
一个，100ml量筒一个，50ml量筒一个，研钵，玻璃棒，恒温水浴锅，漏斗，纱布，塑料膜，橡皮筋。
四、实验步骤
（一）标准曲线制作
分别取0.5 mg/ml没食子酸标准溶液0，1ml，1.5ml，2ml，2.5ml，3ml，4ml，5ml于试管中加水稀释至5ml，再分别取得到试液1mL于试管中，加入蒸馏水4mL 和酒石酸铁溶液5mL，摇匀，再加入pH 值7.5 的磷酸盐缓冲液稀释至25ml，选择540nm 波长和1cm 的比色杯测定吸
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光值，以吸光值为纵坐标，多酚类质量为横坐标(ug）绘制标准曲线。 （二）苹果多酚类的提取和含量测定
1、预处理：将成熟的新鲜苹果洗净加入少量Vc捣碎，称取50g样品。
2、提取：量取100ml，60%的乙醇，加入装有苹果泥的三角瓶中，用塑料膜封口，于60℃恒温水浴锅中搅拌浸提2h。(此步骤需提前准备)
3、浓缩：2h后取下塑料膜，使乙醇挥发殆尽（常温下很难挥发，可在沸水浴中加热挥发），（用3层纱布过滤或者）4000转/分钟离心10分钟，量取上清液1ml（稀释至5ml，若浓度低则不稀释）作为待测样品。
4、测定：吸取待测样品1mL放在试管中，加入蒸馏水4mL 和酒石酸铁溶液5mL，摇匀，再加入pH 值7.5 的磷酸盐缓冲液稀释至25ml，以蒸馏水代替样品试液，加入同样的试剂作空白，选择540nm 波长和1cm 的比色杯测定吸光值。
五、结果分析与讨论
1、计算苹果中多酚物质的含量 2、本实验的关键步骤是什么 2、评价实验结果，提出改进的意见
注意：最后一次实验，要观察上次做的溶菌酶结晶实验结果，并把实验现象和实验结果（把粗的溶菌酶离心后收集沉淀，并称重，计算溶菌酶的湿重得率）写到实验八里。
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