发布时间 : 星期六 文章0776细胞工程技术-大纲及重点 - 图文更新完毕开始阅读e9c482ad1711cc7930b716a3
离体授粉基本步骤：1.采集花粉。2.剥取子房或胚珠。3.授粉：(1)子房试管授粉：1)直接引入法：无菌条件下，切开子房壁或顶端，滴入花粉悬浮液，进行培养。2)注射法：用无菌注射器吸取花粉悬浮液，注入子房，基部切口可用凡士林封口，然后接种于培养基上。(2)胚珠试管授粉：1)哺育法：将胚珠表面选蘸满有助于花粉萌发的培养基后进行接种培养，然后在胚珠上撒播花粉使之受精。2)接近法：将花粉预先撒于培养基上培养使之萌发或不萌发，然后接种胚珠或子房培养。
第六章 植物原生质体的分离、培养和融合 一、学习目的与要求
了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理，熟悉体细胞杂交的方法，杂种筛选的原理和杂种细胞的鉴定 二、考核知识点与考核目标
（一）原生质体的性质和应用（重点） 识记：原生质体的特点 、性质 理解：原生质体的应用领域
植物原生质体是脱掉了细胞壁的、仅有质膜包围的、裸露的、活植物细胞。
原生质体特点：游离的原生质体是真正的单细胞，在同一时间内能得到大量的遗传上同质的原生质体，用它可象细菌细胞那样进行多种遗传学研究。除去了细胞壁的原生质体能超越性细胞的一些不亲和障碍，为较远缘的植物细胞杂交提供了融合的亲本。原生质体能有效地摄取多种外源颗粒，如DNA，质粒、病毒、细菌和其它细胞器。植物原生质体也和植物细胞一样，具有遗传全能性。
原生质体的应用：植物遗传工程、细胞工程、生物学基础研究；研究细胞膜与信息的传递，能量的转换，物质的运输；在细胞器的移植中，原生质体是良好的受体，又是分离细胞内各种细胞器的好材料。
（二）原生质体的分离（次重点）
识记：植物细胞壁的成份，酶解液的主要成份及其作用 理解：各种分离原生质体材料的优缺点 应用：分离植物原生体的方法
植物细胞壁的主要成分：纤维素、半纤维素、果胶质和少量的蛋白质。
原生质体分离常用的酶种类：纤维素酶类（降解细胞壁中的纤维素和半纤维素）、果胶酶类（降解细胞之间的中胶层）、蜗牛酶（分解孢粉素和木质素）和胼胝质酶（分解胼胝质）。
制备原生质体的材料：植物体的幼嫩部分是制备原生质体的理想材料。1.幼嫩叶片：来源广泛，取材方便，叶肉细胞排列疏松，酶的作用易达细胞壁，且有明显叶绿体存在。2.无菌实生苗的子叶和下胚轴：易于消毒，种子萌发条件易控，可保证实验材料的一致性；实生苗能提供大量发育同步的幼嫩细胞，具较强的生活力和分化力。但是杂合程度高，遗传分离较大。3.外植体来源的愈伤组织和悬浮培养细胞系：用作分离材料实验重复性好，原生质体的产量、活性和稳定性比较理想。但常会发生变异。4.花粉细胞：群体数量大、一致性好，取材方便，且是单倍体。
分离原生体的方法：1.机械分离法：不易损伤细胞，但分离效果低，现已很少使用。2.酶解分离法：将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中，保温一段时间，在酶液作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力原生质体。酶解法有顺序法和直接法。顺序法：也称两步法，先用果胶酶处理材料，使单细胞分离，再用纤维素酶水解细胞壁从而得到原生质体。直接法又称一步法，直接用果胶酶和纤维素酶的混合物处理材料获得原生质体。此法常用。
（三）原生质体的培养（次重点）
识记：液体浅层培养法和固体平板法的含义及优点
理解：原生质体活力测定的原理及方法，原生质体发育及植株再生的过程的主要步骤以及培养和检测的方法
液体浅层培养法：一般在直径6cm的培养皿中培养2mL原生质体悬浮液，或在方形或圆形细胞培养瓶中培养。采用静置培养。优点：操作简便，对原生质体伤害小，通气性好，代谢物易扩散，易于补充新鲜培养
基，原生质体易吸收营养物质，形成细胞团或小愈伤组织后易于转移。缺点：分布不均，常粘连，难以定点观察和跟踪单个原生质体的生长发育过程。
固体平板法：把原生质体均匀地埋入琼脂培养基中的培养方法。一般在直径6cm的培养基中加3mL含有原生质体的琼脂培养基作平板培养。优点：原生质体被彼此分开固定，可避免细胞间有害代谢产物的影响，有利于对单个原生质体细胞观察。缺点：操作要求严格，特别是混合时温度必须合适。 原生质体活力测定的方法：1.形态识别法：把形态上完整，富含细胞质，颜色新鲜的原生质体放到低渗液中，可见到分离后缩小的原生质体会恢复原态，成为正常膨大的一般是有活力的原生质体。2.染色法：1）荧光素二乙酸酯(FDA)染色法：发绿色荧光的为有活性的原生质体。2）伊凡蓝染色法：不着色的是有活力的原生质体。3）酚藏花红染色法：有活力的原生质体不染色。
植株再生过程：细胞壁再生——细胞分裂——植株再生（愈伤组织途径/胚状体途径）
（四）体细胞杂交（重点）
识记：原生质体融合，体细胞杂交，PEG，电融合，细胞杂种和胞质杂种，同核体，异核体等的概念 理解：细胞杂种和胞质杂种的来源和区别及意义 应用：用PEG诱导原生质体融合的主要实验步骤
细胞融合是指不同的细胞在离体条件下接触，用无性的方法使其成为一体而产生杂种细胞的技术。植物细胞和微生物细胞在细胞融合前须预先处理除去细胞壁，因此植物细胞和微生物细胞融合一般就称为原生质体融合。
植物原生质体融合也称体细胞杂交。 PEG：聚乙二烯。
电融合：用改变电场的方法诱导原生质体的融合称为电诱导融合法。
在植物原生质体的融合过程中，除了产生双亲原生质体融合的异核体外，还能形成具有双亲不同比例的多核体，同源原生质体融合的同核体，以及不同胞质来源的异胞质体等等。
细胞杂种(Hybrids)：亲缘关系较近的细胞融合，得到的杂种植株是可育的，其大多具有双亲的细胞核和细胞质的遗传物质，它们一般是亲和的细胞杂种；亲缘关系较远的细胞融合有可能形成以一个亲本的细胞核遗传物质为主，而转入另一亲本少量的遗传物质，它们是部分亲和的细胞杂种。以上统称为细胞杂种。
胞质杂种(Cybrids)：从具有双亲的核与质的异核体中，可以分离出具有一个亲本的细胞核和另一亲本的细胞质的胞质杂种。这种胞质杂种常常由去核的亚原生质体和另一有核的原生质体融合而成，可用射线照射某一亲本，或用细胞松弛素处理，使其选择性地丢失核基因，融合后获得一个亲本的核基因和另一亲本的细胞质的胞质杂种。
PEG诱导原生质体融合的主要步骤：1.从双亲分别制备原生质体。2.混合二亲本原生质体。3.诱导融合处理。（用滴管沿原生质体小滴边缘加入PEG诱导剂，室温培育10-20min）4.缓缓加入几滴高pH高钙液，持续15min。加入冲洗液，最后将稀释液收集于离心管中，离心收集原生质体。5.将处理后的原生质体作镜检并作培养。
（五）体细胞杂种筛选（重点）
识记：互补选择法，NR-，同功酶，分子杂交，机械分离法等概念 理解：建立筛选方法的重要性，互补选择法的几种类型 应用：根据互补选择法的原理设计选择程序
互补选择法：两个具有不同生理或遗传特性的亲本，在一定的培养条件下形成杂种细胞时能产生互补作用，根据这一特性进行杂种细胞选择的方法，称为互补选择法。包括互补生长，营养缺陷型互补，白化体和野
生型互补，抗性互补选择。
NR-：硝酸还原酶（nitrate reductase，NR）是植物氮素代谢作用中的关键性酶，它与作物吸收和利用氮肥有关。NR作用于NO3-使其还原为NO2ˉ：NO3ˉ+NAD(P)H+H+→NO2ˉ+NAD++H2O 产生的NO2ˉ 可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO2-含量的增加，即可表现NR活性的大小。 同工酶：isozymes，是指生物中存在的的结构、大小和形状不同而催化同一反应的酶。它是不同有机体的天然标记，广泛用于细胞杂种的鉴定。 分子杂交法：首先制备杂种DNA，并且用限制性内切酶切成许多特异性片断，用琼脂糖凝胶电泳进行分离；然后将凝胶中的DNA片断吸印到硝酸纤维滤膜上，并加热固定，使DNA成单链牢牢地吸附在滤膜上，然后将滤膜与放射性标记的探针DNA作杂交温育反应。通过放射自显影，就可确定细胞杂种的DNA中是否具有双亲的互补序列。
机械分离法：以上各种选择系统都要求有突变体，然而在植物中，目前很难做到象在微生物中那样有许多突变体，因此机械分离法有很大意义。用离心方法可以把异核体与亲生原生质体分开，从而获得融合体。采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。
异源融合体，特别是远缘不亲和的杂种细胞在不经过选择的情况下，常常因它们发育缓慢而受到优势生长的亲本原生质体融合细胞的抑制，不易发育成杂种。因此设计选择体系，优先选择杂种细胞。 杂种细胞的选择程序：
R -R+
抗药物A的 抗药物B的 X缺陷型 X原养型 A X B X A X- RAR/+ X/X- BR/+ BR X+ 抗A和B的 原养型杂种 植于附加药物A和B，但无营养物质X的培养基上 死亡 细胞分裂生长死亡