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第七章 体细胞无性系及突变体筛选 一、学习目的与要求
通过本章学习，了解植物体细胞无性系变异的机理及应用，细胞突变体的类型，各类突变体诱发筛选的方法和突变体在细胞工程中的应用 二、考核知识点和考核目标 （一）体细胞无性系（次重点）
识记：体细胞无性系概念，特点，染色体变异（数量和结构），转位因子等的概念 理解：体细胞无性系变异发生的机理
Larkin和Scowcroft(1980)把离体培养所获得的再生植株统称为体细胞无性系（somaclone），而将这些植株所表现出的变异（包括形态、生理生化、育性、抗性等方面）定义为体细胞无性系变异。
体细胞无性系变异的特点：变异广泛；后代稳定性；能基本保持原品种特性；潜在隐形性状活化。 染色体数目变异：植物离体培养引起染色体数目变化的现象相当普遍，以整倍性或非整倍性变化为多。 染色体结构变异：主要发生在植物离体培养细胞的分裂过程中，染色体部分片断断裂，在修复连接时染色体发生易位、倒位、缺失和重复，染色体重排的结果使得某些性状发生改变。
转位因子：即移动基因，包括IS因子和转位子，其分子本质是一段能够插入到寄主基因组新位点的特异的DNA序列。
体细胞无性系变异发生的机理：细胞水平的变异包括染色体数目变异（整倍性或非整倍性变化）、染色体结构变异（易位、倒位、缺失和重复）；分子水平的变异包括核基因突变（基因序列中的碱基发生了变化）、DNA总量变异和NDA重复序列拷贝数的变异、基因丢失、DNA碱基修饰（甲基化或去甲基化）、转座子的激活、基因重排。此外有人工诱发变异。
（二）细胞突变体分类（重点）
识记：细胞突变体的概念和基本特征，营养缺陷型，抗性突变体的概念 理解：在离体细胞水平上诱发筛选突变体的优越性，突变体发生的原理
在离体细胞水平上诱发筛选突变体的优越性：
突变体发生的原理：
（三）诱变和机理（重点）
识记：诱变因子，DNA修复，BUdR, 烷化剂，EMS，读码框，移码突变，最适剂量
理解：诱发和筛选细胞突变体对材料的要求，不同材料用于细胞突变体筛选的优点，化学诱变剂作用的原理（天然碱基类似物，烷化剂，吖啶类物质）
诱变因子：物理诱变：X射线、γ射线、β射线、中子、激光、电子束、离子束、紫外线等；化学诱变：碱基类似物、烷化剂、DNA分子结构插入物。 DNA修复：自然界存在各种途径用来修复活生物体中可能发生的各种突变。在校对中没有纠正的错误碱基，
可以通过错配把它替换掉。这个修复系统能够识别非氢键结合的碱基对，切除错误的碱基并用一个正确的碱基替换之。
BUdR：5溴脱氧核苷。为化学诱变剂，属于碱基类似物。 烷化剂：
EMS：甲基磺酸乙酯，是属于烷化剂诱变最常用的一种，诱变率很高。常用浓度0.05-0.5mol/L，作用时间5-60min。该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。
读码框：读码框（reading frame）代表一个氨基酸序列的mRNA分子的非重叠密码序列。一个mRNA读码框是由翻译起始密码（通常是AUG密码）确定的。
移码突变：在正常的DNA分子中，碱基缺失或增加非3的倍数，造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。
最适剂量：最适诱变剂量，也就是在提高突变率的基础上，即能扩大变异幅度，又能使变异向正向突变范围移动的剂量。 诱变材料的要求：
用于突变体筛选最理想的材料为单细胞或原生质体。也可用茎尖、腋牙等，但容易形成嵌合体。目前使用最多的材料是愈伤组织。
化学诱变剂作用的原理： 1. 碱基类似物的作用机制：作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去，使DNA复制时发生配对错误，从而引起有机体变异。2.烷化剂的作用机制--烷化作用，作用重点是核酸，导致DNA断裂、缺失或修补。3.吖啶类：移码诱变剂系指能够引起DNA分子中组成遗传密码的碱基发生移位复制，致使遗传密码发生相应碱基位移重组的一类化学诱变物质，主要为吖啶类杂环化合物，常用的有吖啶橙和原黄素两种。4其他：.DNA分子结构插入物：通过引起DNA分子遗传密码的阅读顺序发生改变而导致突变，如亚硝酸；叠氮化钠(NaN3) 是一种呼吸抑制剂，能引起基因突变，可获得较高的突变频率，而且无残毒。
（四）突变体筛选（重点）
识记：正选择法、负选择法的概念，正选择剂、负选择剂、诱变剂的概念，一步选择法，多步选择法 理解：正选择法和负选择法的区别、鉴别突变体的条件 应用：正选择法和负选择法在细胞突变体筛选中的运用
正选择法：在离体培养基中加入对正常细胞有害的化学物质（选择剂），使正常表型细胞死亡而突变细胞可
以生长，从而将其分离出来。如
一步选择法：所用筛选压可一次性地消灭正常型细胞，对单基因性状的抗性筛选非常方便。
多步选择法：先加入低剂量的选择剂，选出生长较好的细胞，再逐步加大剂量，最终得到可耐受最高选择浓度的突变细胞团。
负选择法：使用特定培养基，让突变体细胞受到抑制不分裂呈休眠状态，而正常表型细胞正常生长，然后用一种对休眠态突变细胞无害，而能毒害正常生长细胞的药物淘汰掉正常型细胞，最后用正常培养基恢复突变细胞的生长。现在常用5-溴去氧尿苷负选择系统和高氯酸盐负选择系统。该方法主要用于营养缺陷型突变体筛选。
鉴别突变体的条件：一般认为真实的遗传变异应满足以下条件：离开筛选压后变异表型持续稳定；突变体中具有相应变化的基因产物或生理生化上的代谢差异；变异表型能够通过有性繁殖遗传。
（五）细胞突变体应用（次重点）
应用：根据突变体的类型和特点掌握其在理论研究和细胞工程中的用途