发布时间 : 星期四 文章0776细胞工程技术-大纲及重点 - 图文更新完毕开始阅读e9c482ad1711cc7930b716a3
第八章 植物肿瘤发生和基因工程载体 一、学习目的与要求
通过本章的学习，了解根癌农杆菌诱发冠瘿瘤的机理，Ti质粒和T-DNA的功能和植物基因工程载体的构建方法。
二、考核知识点与考核目标：
（一）根癌农杆菌与植物的相互关系（重点）
识记：根癌农杆菌、冠瘿、冠瘿碱、Ti质粒、T-DNA、遗传性寄生等的概念 理解：冠瘿瘤的特征及分类，冠瘿形成的分子机理
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常特殊的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。
Ti质粒：为植物根癌土壤杆菌（Agrobactertium tumef-aciens）菌株中存在的质粒，其特定部位与植物核内DNA组合来表达信息，使植物细胞肿瘤化。即此质粒既有在细菌中表达的基因，又有在高等植物中表达的基因，这是很独特的。
Ti是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子。它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。Ti是英文肿瘤诱发（tumor-inducing）的缩略式。
T-DNA（Transfer DNA）即转移DNA，又名三螺旋DNA，是一种由三股ssDNA旋转螺旋行成的一种特殊脱氧核糖核苷酸结构。
T-DNA是Ti质粒上的一个片断。利用农杆菌等微生物可将人工合成的目的基因片段通过T-DNA载体转移到受体植物的基因组中，是基因工程的重要技术手段。 T-DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱。T-DNA技术是构建突变体库，反向遗传学的突破性技术之一。
冠瘿瘤的特性：平常的植物肿瘤，多少有一点自制性，到一定程度后不再生长。但是很多冠瘿瘤，特别在人工分离后，似可无限生长。经组织嫁接后，可不断诱导形成新肿瘤。 冠瘿瘤细胞的染色体中，含有来自农杆菌的致瘤质粒片段(T～DNA)，T～DNA整合入植物细胞核的染色体中，能稳定存留，且随植物肿瘤细胞的分裂而复制。它携带的一些基因，在植物细胞中控制着肿瘤的表型。 冠瘿瘤的分类：根据诱发冠瘿瘤的农杆菌品系的不同，可以产生不同类型的冠瘿瘤。由章鱼碱型Ti质粒的农杆菌所诱发的肿瘤是不定型无组织状态的；另一类是具有形态差别的冠瘿瘤，能从瘤中生长出具有部分茎状组织与叶状结构。人们称其为畸胎瘤（teratomas），它通常是由胭脂碱型Ti质粒农杆菌所诱发的。 冠瘿形成的分子机理：在农杆菌中存在着一类专一性诱瘤的质粒，即Ti质粒（tumour inducingplasmid）。在
质粒上带有致瘤基因，在诱瘤期间，Ti质粒的一段DNA，即T-DNA（被转移的DNA）能进入植物细胞，并整合到植物细胞的核DNA中。T-DNA能在受体细胞中复制转录和表达，从而使得植物细胞发生转化，成为肿瘤细胞。
（二）Ti质粒的性质和功能（重点）
识记：章鱼碱、胭脂碱、治愈菌株、Ocs基因、Nos基因、Shi基因、Roi基因
理解：Shi基因和Roi基因表达和突变与诱发冠瘿瘤之间的关系，T-DNA转移和整合的机制 应用：从T-DNA基因的表达理解冠瘿瘤组织能在无激素培养基上生长的分子机理
Ti质粒根据冠瘿碱种类不同，可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱型(succinamopine)。
致病菌株在37℃培养，Ti质粒被消除，成为治愈菌株；治愈菌株与致病菌株结合，重新获得Ti质粒，又成为致病菌株。
非同源序列编码瘿冠碱合成酶，章鱼碱型酶叫Ocs，在胭脂碱中叫Nos。 shi基因与生长素合成有关，roi基因与细胞分裂素合成有关。
（三）农杆菌载体构建（次重点）
识记：中介载体、穿梭载体、共整合质粒，报告基因
理解：野生型Ti质粒不能作为载体的理由及改造的主要方法与步骤，报告基因的条件和种类
中间载体：为了使Ti 质粒成为有效的外源基因导入载体，科学家们将T-DNA片段克隆进大肠杆菌的质粒，并插入目的基因，而后通过接合转移将目的基因引入到根癌农杆菌的Ti 质粒。带有重组T-DNA的大肠杆菌衍生载体称为中间载体(intermediate vector)，而接受中间载体的Ti 质粒则称为受体Ti 质粒(acceptor Ti plasmid)。构建中间载体是解决Ti 质粒不能直接导入目的基因的有效方法之一。
穿梭载体(shuttlevector)一般指能在两种(例如原核细胞与真核细胞间)或多种宿主之间进行复制和、或表达的载体。
共整合质粒：由标准的大肠杆菌质粒和土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA区段重组改造而成的，按共整合方法将外源基因转移到宿主植物的一类专用载体。
报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。
野生型Ti 质粒不能直接用作克隆外源基因的载体。这主要表现在：①野生型Ti 质粒分子过大，因而在基因工程中操作起来十分麻烦；②野生型Ti 质粒上分布着各种限制型核酸内切酶的多个酶切位点，不论用何种限制型核酸内切酶切割，都会切成很大片段。而且即使在T-DNA 上也很难找到可利用的单一的酶切位点；③T-DNA上的tms和tmr 基因产物将干扰受体植物内源激素的平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍转基因植物细胞的分化和植株的再生；④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢；⑤野生型Ti 质粒没有大肠杆菌(Escherichia coli)的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。因此，必须对野生型的Ti 质粒进行改造后才能作为转基因植物的载体。
对野生型Ti 质粒的改造，主要包括以下几个方面：①删除T-DNA上的tms、tmr和tmt基因；②加入大肠杆菌复制起点和选择标记基因，构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒，便于重组分子的克隆与扩增；③引入植物细胞的筛选标记基因，如细菌来源的新霉素磷酸转移酶II基因(neomycin phosphotransferase II, NPT II)等，便于转基因植物细胞的筛选；④引入植物基因的启动子和polyA化信号序列；⑤插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。⑥除去Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度。