发布时间 : 星期一 文章0776细胞工程技术-大纲及重点 - 图文更新完毕开始阅读e9c482ad1711cc7930b716a3
农杆菌圆球体转化植物原生质体：用农杆菌转化植物细胞，可能会受到宿主范围的限制，因此有些科学家用特异性酶处理农杆菌，使它周围的细胞壁去掉而成为原生质球，然后在诱导剂的协助下与植物原生质体融合，从而促使农杆菌的质粒DNA与植物细胞核DNA重组。
制备农杆菌球质体：培养农杆菌，离心收集菌体，悬浮于缓冲液中，然后加入溶菌酶，在30℃处理2小时，结果使杆状的细菌转变为原生质球。
（三）DNA介导基因转移（重点）
识记：Ti质粒转化、直接基因转移、电激法、微注射法、花粉管通道法和基因枪转化的含义
理解：pNos-APH3’Ⅱ-pAocs的含义，外源基因以组成型方式表达的遗传学分析，脂质体作为载体的优点和与细胞相互作用的方式
植物基因转移的农杆菌有两种类型，即含有Ti质粒的根癌农杆菌和含有Ri质粒的发根农杆菌。
Ti质粒转化：Ti质粒是致瘤质粒，感染植物后，引生冠瘿瘤。Ti质粒可分为三种类型：章鱼碱型、胭脂碱型和琥珀碱型。
直接基因转移：基因直接导入法是指通过物理或化学方法直接将外源基因导入植物细胞的方法，包括基因枪法、电激法、微注射法、花粉管通道法等。
基因枪法：又称微弹轰击法，其基本原理是将带有目的基因的质粒DNA包被在微小的金粒或钨粒表面形成微弹，然后利用基因枪装置加速将微弹送入细胞内，从而将外源DNA带入细胞，整合到植物的基因组DNA中。
电激法：利用高压电脉冲的“电激穿孔”作用造成细胞膜上出现短暂可逆性开放小孔，为外源基因提供通道，DNA分子通过小孔进入细胞内并整合到受体细胞的基因组上。
花粉管通道法；在植物授粉后适当时间，将花柱上端切去，在切口上滴入（或注射）外源DNA，使其沿花粉管道进入胚囊，与受精卵或胚细胞接触而转化。转化后的种胚在子房内原位发育，最后长成正常的种子。 显微注射法：利用特制的显微注射仪在显微镜下将外源遗传物质直接注射入植物细胞的转化方法。需要将植物细胞进行固定才能注射。
外源基因的表达需要有位于结构基因两侧的信号序列的调控，特别是受体细胞的转录调控系统要能够识别外源基因的启动区，而Ti质粒中的胭脂碱合成酶基因(nos)的启动区正好具有这一性能。因此，在植物细胞遗传工程中，为了使外源基因在植物细胞中表达，科学家将这种基因和一个已知能在植物细胞中有功能的基因启动区拼结在一起，构建成嵌合基因，带有嵌合基因的质粒也称为表达载体。许多实验证明，通过表达载体引入的外源基因就能在植物细胞中表达。
脂质体作为载体的优点：能保护细胞内部的遗传物质；与植物细胞相互作用时，毒性很小；受体广，对原核细胞和真核细胞均适用；制备脂质体容易，价格低廉。 脂质体与细胞相互作用的方式：（1）内吞作用：脂质体靠近原生质体，原生质膜发生内陷，逐渐将脂质体吞入原生质体。（2）融合作用：脂质体膜与原生质体膜靠近产生融合，使内含物或脂质体进入胞内。当发生融合作用时，一般需要加入聚乙二醇或二价阳离子。（3）交换作用：脂质体膜与原生质体膜互相交换脂类，在此过程中使内含物进入细胞。
进入细胞的脂质体将与溶酶体融合，并逐渐被降解，使内含物放出来。
第十章 真核细胞基因工程 一、学习目的与要求
通过本章的学习，了解用于表达基因工程药物的真核系统的类型、原理及其应用 二、考核知识点与考核目标 （一）表达系统（次重点）
识记：原核表达系统，真核表达系统，转基因生物反应器，细胞反应器的概念 理解：原核表达系统与真核表达系统的特点的比较，真核表达系统的类型
原核表达系统：广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。狭义的原核表达，常出现于生物工程中。是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。原核表达系统是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。
真核表达系统：将原核基因调控系统引入真核基因调控领域。利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
转基因生物反应器：将外源基因转入细胞或动植物，利用细胞增殖或者动植物代谢制备外源基因的表达产物的技术。
转基因动物细胞生物反应器：将外源基因转入动物细胞，表达制备相关产品。利用转基因动物细胞生产蛋白类药物、疫苗、细胞因子等产品已经成为生物制药的热点。
原核表达系统与真核表达系统比较：
原核表达系统即在原核细胞中插入外源基因并可以转录翻译表达蛋白。
一般常用的原核表达系统有：大肠杆菌表达系统、链霉菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统。
优点：1.宿主菌生长快，培养简单，操作方便；2.价格低廉；3.来源清楚，基因安全；4.蛋白表达量高。 真核表达系统一般有：酵母表达系统、哺乳动物表达系统、昆虫表达系统。
优点：1.可以进行翻译后修饰如糖基化、磷酸化、寡聚体等高级结构的正确折叠；2.可为分泌型，提纯工艺简单；3.可用为基因药物，辅助疾病治疗。
（二）昆虫细胞表达系统（重点）
识记：杆状病毒、感染、转染、共转染、多角体、表达载体、感染复数等的概念
理解：昆虫细胞杆状病毒表达系统的优点和特点，外源基因插入病毒基因组的原理，体外昆虫细胞培养的方法
应用：用昆虫细胞表达和生产重组蛋白药物的应用
杆状病毒：可以感染昆虫的病毒大约有1200多种，分属于7个不同的科，杆状病毒是其中最普遍的一群。杆状病毒分为三个亚群：核型多角体病毒、颗粒状病毒与非包涵型杆状病毒。
感染：医学概念，常指病原微生物（细菌、真菌、病毒等）侵入机体导致的病理生理过程。
转染：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。
共转染：表达一个DNA分子上的基因标记的细胞经常也表达另一个DNA分子携带的基因标记，这种物理上不相连的基因被整合到同一整合序列并在同一转染细胞内表达的现象叫做共转染。 多角体：多角体polyhedra 是指随着某种昆虫病毒的感染，核内或细胞质中形成直径0.5—10微米的多面体，由晶状排列的碱溶性蛋白质组成，中间包藏着数目不定的病毒粒子。它的功能是保护病毒颗粒免受外界各种不良环境的破坏，它对各种蛋白分解酶有抗性，而在碱中易溶解，释出病毒粒子。
表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。
感染复数：感染时噬菌体与细菌的数量比值，即平均每个细菌感染噬菌体的数量。
昆虫细胞杆状病毒表达系统的优点和特点：