发布时间 : 星期一 文章最终版PCR SOP体系文件更新完毕开始阅读edf14ee867ec102de3bd898f
7.2.1 向干燥后的沉淀管加入18μl PCR反应液Ⅰ打匀，再加逆转录酶系2μl，振荡混匀； 7.2.2 37℃放置45分钟，95℃加热3分钟。8000rpm离心1分钟，待用。 7.3 PCR扩增
7.3.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（HCV PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。
7.3.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入逆转录后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液5μl，或直接加入阳性定量参考品5μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
7.3.3 设置PCR循环扩增程序如下
93℃ 2分钟 预变性；
93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环
8 结果判断：
8.1 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则判样品的HCV RNA总含量小于检测极限。 8.2 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则按以下方法判断： a ) 若样品的C<1.00E+003，则样品HCV RNA总含量<1.0×103 IU/ml。 b ) 若样品的1.00E+003≤C≤1.00E+008，则样品HCV RNA总含量为C IU/ml； c ) 若样品的C>1.00E+008，则样品HCV RNA总含量>1.0×108 IU/ml。如果需要精确定量结果，
可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测；
9 质控
a ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30； b ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在5.0×106IU/ml~5.0×
108IU/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在2.0×103IU/ml~5.0×105IU/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）； c ) 阳性定量参考品：增长曲线呈S型曲线，Ct值<27，且线性相关系数0.97≤|r|≤1； d ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
10 参考范围
低于检测下限
11 性能指标
检测限：1.0×103IU/ml
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线性范围：1.0×103IU/ml~1.0×108IU/ml
12 临床意义
HCV是引起输血后肝炎的主要因素，其在血中的含量极低，仅为HBV的1%，其免疫学标志只有抗-HCV 和核心抗原两项，且至今病毒分离尚未成功，所以HCV的检测存在一些问题，因此，RT-PCR技术在HCV的检测中非常重要。由于个体间免疫功能的差异，部分患者出现抗-HCV较晚，免疫功能低下者和经免疫抑制治疗者甚至可能不产生抗-HCV，因此HCV-RNA是HCV感染的确诊标志。即使在“窗口期”，也可检测出HCV RNA。
13 注意事项
13.1 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
13.2 为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
13.3 对每次实验进行质量控制；
13.4 由于涉及RNA操作，应严防RNase的污染； 13.5 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融；
13.6 反应管中加入RNA模板后，应尽快完成荧光测定，开始PCR反应；
13.7 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃； 13.8 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
13.9 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
14 参考文献
中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第三版) ．南京：东南大学出版社，2006
中山大学达安基因股份有限公司.丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR—荧光探针法）说明书.2009年7月，第一版/0
批准记录 批准人 批准时间 有效期 □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： 第 19 页/共 93 页
人巨细胞病毒核酸定量检测标准操作程序 发布部门:XXXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXX 审核者:XXX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-103 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 1 项目名称
人巨细胞病毒核酸定量检测
2 检验方法名称
TaqMan荧光定量检测
3 方法学原理
选用人巨细胞病毒株（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计一对针对该区域的特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
4 标本要求
4.1 适用标本类型：尿液、乳汁、血清或全血等。
4.2 尿液、乳汁：取晨尿或成熟乳10ml于无菌的干燥玻璃管中，密闭送检；
4.3 血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无抗凝剂普通试管，待凝固后1500r/min离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管；
4.4 全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管，轻轻颠倒混匀5~10次，使抗凝剂与静脉充分混匀。全血标本可立即用于测试，也可保存于4℃待测，保存期为24小时。
4.5 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测（全血除外），保存期为6个月。
5 试剂
5.1 试剂名称：人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 5.3 试剂货号：#DA-B061； 5.4 包装规格：20人份/盒； 5.5 试剂成份： 组成部分 DNA提取液（500μl/管） HCMV PCR反应液（400μl/管） Taq酶（60μl/管） 第 20 页/共 93 页
数量 2管 2管 1管
组成部分 DNA浓缩液（2000μl/管） HCMV阴性质控品（50μl/管） HCMV弱阳性质控品（200μl/管） HCMV弱阳性质控品（200μl/管） HCMV阴性质控品（250μl/管） HCMV阳性定量参考品（1.0×104IU/ml）10μl/管 红色 HCMV阳性定量参考品（1.0×105IU/ml）10μl/管 黄色 HCMV阳性定量参考品（1.0×106IU/ml）10μl/管 蓝色 HCMV阳性定量参考品（1.0×107IU/ml）10μl/管 绿色 5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。
数量 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 6 仪器
ABI 7500全自动基因扩增检测仪
7 操作步骤
7.1 DNA提取
7.1.1 阴性质控品处理
取出阴性质控品，8000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000r/min离心5min，备用。
7.1.2 标本处理
7.1.2.1 乳汁（尿液处理同乳汁） a ) 摇匀乳汁，取1ml至1.5ml离心管中，12000rpm离心5min； b ) 去上清，沉淀（沉淀如不明显，重复上述步骤）加灭菌生理盐水1ml混匀，12000rpm离心
5min； c ) 12000r/min离心5min，备用。 7.1.2.2 血清 a ) 取100μl血清加入等量DNA浓缩液，充分混匀； b ) 12000r/min离心10min； c ) 去上清，沉淀中加入20μl DNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟； d ) 12000r/min离心5min，备用。 7.1.2.3 全血 a ) 取全血1ml至干燥玻璃试管中，加入生理盐水1ml轻摇混匀； b ) 取干燥玻璃试管卷入500μl淋巴细胞分离液； c ) 将稀释好的全血用加样枪缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中（注意沿管壁，速度要慢）； d ) 2000rpm离心20min； e ) 吸取白细胞层（从上而下的第二层），加入1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟； 以下处理同7.1.2.1.b~7.1.2.1.c
7.1.3 HCMV弱阳性质控品处理（同阴性质控品）； 7.1.4 HCMV强阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.5 HBV阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 7.2 PCR扩增
7.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（TB PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。
7.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、
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