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枯草芽孢杆菌发酵生产α-淀粉酶
一、 实验目的
了解枯草芽孢杆菌发酵的基本过程
二、 实验原理
α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业都经常使用。α-淀粉酶（EC.3.2.1.1）作用淀粉时可从分子内部切开α-1,4-糖苷键而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为α-构型，故称α-淀粉酶。
α-淀粉酶的分子量范围是15600-139300，通常为45000-60000，可分为耐热、耐酸、耐碱和耐盐酶。α-淀粉酶可由微生物发酵产生，也可从植物和动物细胞中提取，目前工业上都以微生物发酵法进行大规模生产α-淀粉酶。
三、 实验材料和方法
1、 菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
2、 种子培养基
牛肉膏 1；蛋白胨 2；Nacl 1；pH7.0-7.2
3、 发酵培养基
可溶性淀粉 10；（NH4）2SO4 2.6；KH2PO4 5.7；K2HPO4 1.7；pH 7.0-7.2
4、 仪器设备
超净工作台、摇床、培养箱、紫外可见分光光度计等。
四、 实验步骤
（一） 种子培养
将冰箱中保存的斜面菌种在30℃恒温培养箱中活化3h，取一环接种至摇瓶中，30℃下置于摇床中培养16-18h，即得新鲜种子液。
（二） 摇瓶发酵培养
500mL摇瓶中装有50mL已灭菌的发酵培养基，用无菌的移液管吸取5mL种子液接入摇瓶，在摇床中与30℃和200r/min条件下培养48h。结束时将培养液离心，收集上清液放入冰箱中冷藏保存，集中测定α-淀粉酶的酶活大小。
五、 实验结果
测发酵结束时的细胞生物量和pH值。此次实验未进行测量。
硫酸铵沉淀法分离纯化（透析）α-淀粉酶
一、 目的和要求
1、 了解保有蛋白质活性的浓缩方法。 2、 掌握硫酸铵沉淀法浓缩α-淀粉酶的方法。
二、 实验原理
当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀。这一技术称为“盐析”。不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，所以盐析常用于蛋白质的分离纯化。几种因素如pH、温度、蛋白质纯度在测定各种蛋白质的盐析点时起着重要作用。
选择硫酸铵是因为它具有一些优良性质，如盐析的有效性、pH范围广、溶解度高、溶解散热少和经济适用。
硫酸铵浓度常以百分浓度表示。以X%表示所要配制的溶液浓度，X0%表示开始的溶液浓度，所需要的硫酸铵克数按以下公式计算：
g=515（X-X0）/（100-0.27X） （0℃时1L溶液，用量见附录3） 大多数蛋白质在55%硫酸铵中沉淀，获得最大量蛋白质沉淀是85%硫酸铵溶液，以不含硫酸铵的100mL蛋白质溶液为起始溶液，按以下操作步骤进行盐析。
三、 步骤操作
（1） 将盛有蛋白质溶液的烧杯放在另一装有冰水的大烧杯内，并置于磁力搅
拌器上搅拌；
（2） 边搅拌，边徐徐加入28.4g硫酸铵至饱和，该步骤应该在5-10min内完
成；
（3） 继续搅拌10-30min；
（4） 10000xg离心10min或3000xg离心30min；
（5） 弃去上清液，将沉淀悬浮于1-2倍沉淀物体积的缓冲液中，残留的不溶
性物质可能是变性蛋白，通过离心除去；
（6） 硫酸铵能够通过透析、超滤或脱盐柱除去； （7） 得到纯化后的α-淀粉酶，溶于20mL缓冲溶液； （8） 紫外分光光度计测定α-淀粉酶的浓度；
（9） 测定α-淀粉酶的活性，与原酶液的活性进行比较。
透析实验 一．
透析的原理
透析是指溶质从半透膜的一侧透过膜至另一侧的过程，任何天然的（如腹膜）或人造的半透膜，只要该膜含有使一定大小的溶质通过的孔径，那么这些溶质就可以通过弥散和对流从膜的一侧移动到膜的另一侧。
人体内的毒物包括代谢产物，药物，外源性毒物，只要其原子量或分子量大小合适，就能够通过透析清除体外。其基本原理是弥散和对流。弥散就是半透膜两侧液体各自所含溶质浓度梯度及它所形成的不同渗透浓度，溶质从浓度高的一侧通过半透膜向浓度低的一侧移动。对流也称超滤，是指溶质和溶剂因透析膜两侧的静水压和渗透压梯度的不同而跨膜转运的过程。 二．
透析袋的使用方法
（一） 透析袋（前处理方法如下）：
1. 把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段。
2. 在大体积的2％（W/V）碳酸氢钠和10mmol/L EDTA(ph8.0)中将透析袋煮沸10分
钟。