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学生实习报告
实习单位: 张 大 兵 实 验 室
实习时间： 2011年7月4日 至 2011年7月24日 学院(系): 生 命 科 学 技 术 学 院 专 业: 生 物 技 术 学生姓名: 梁 冬 丽 学号: 5080809040
2011 年 7 月 25 日
SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY 学生实习报告用纸
水稻雄性不育突变体TF13的基因定位
1. 实习目的
本次实习的主要任务是对TF13进行初定位与精细定位。在此基础之上，我也对突变株TF13制备了半薄切片，欲进行表型观察。
2. 背景介绍
利用水稻小花各轮器官发育异常的突变体来研究单子叶植物花器官发育的分子调控机制是目前植物分子遗传学的研究热点。本研究将粳稻品种9522进行γ射线诱变，从M2代突变体库中筛选到一个雄性不育的突变体，命名为TF13。对这个突变体进行的遗传学分析结果表明此雄性不育性状受一个隐性基因控制。为了对TF13进行基因定位，将其纯合体与籼稻品种广陆矮4号杂交，建立F2代群体，筛选F2代中的突变株，利用已公布的水稻RM系列ssR标记及自行设计INDEL标记，应用图位克隆技术，对TF13位点进行遗传定位。我将TF13进行了初定位和精细定位，最终将TF13定位在8号染色体上。
3. 实验内容
3.1 实验材料 3.1.1 突变体来源
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用coγ射线诱变粳稻9522种子，处理剂量为280Gy。在M2代分离群体中获得一株雄性不育的突变体，将该突变体与9522野生型回交3代，获得隐性单基因控制的突变体TF13。所有植物材料均由实验室提供。 3.1.2 定位群体的构建
将突变体与籼稻品种广陆矮4号杂交，获得F1代。F1代自交获得F2代，大田种植，出现表型后，选择其中的突变植株作为定位群体。本研究中筛选到定位群体284株。 3.1.3 表型观察
大田种植TF13植株。待植株抽穗后，对野生型9522和TF13突变体进行观察拍照。 3.1.4 实验试剂及配方
实验所用的引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 （1） 1.5 × CTAB
CTAB 1.5%
Tris-HCl（pH 8.0） 75 mM EDTA（pH 8.0） 15 mM NaCl 1.05 mM
（2） 氯仿
（3） 6%聚丙烯酰胺母液
丙烯酰胺 500g
尿素 1000g N，N’- 亚甲双丙烯酰胺 26g 5 × TBE 1600mL
加水至 8 L
（4） 硝酸银染色液
2g 硝酸银溶解于2L水中
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（5） 显影液
1.5L水中加入
NaOH 30g Na2CO3 0.6g 甲醛 6mL 3.2 实验仪器 PCR扩增仪
电泳槽(北京六一仪器厂) 电泳仪(北京六一仪器厂) 移液器(Eppendorf) 4℃冰箱(Haier) -20℃冰箱(Haier) 电子天平 高速离心机 压力蒸汽灭菌锅 制冰机 叶片研磨机 3.3 实验方法 3.3.1 提取DNA
根据Murray and Thompson公布的提取水稻总DNA的方法：
（1） 称0.1 g – 0.2 g左右的水稻叶片放入1.5 mL的离心管中，加入4个小钢珠，用研磨
机研磨至粉末。
（2） 加入700μL的100℃的1.5 x CTAB溶液于离心管中，小心混匀后放入65℃水浴，不时
震荡摇晃。约20 – 25 min后取出离心管。
（3） 冷却片刻，加入等体积氯仿，猛烈摇匀，离心13000 rpm，10 min。 （4） 取400μL上清(注意不要带入氯仿)于备好的新eppendorf管中，加入900μL的无水乙
醇，先缓慢混匀，再猛烈混匀几下，使DNA成团，放入-20℃半小时以上。
（5） 13000rpm离心10min。弃上清，将沉淀用1mL的70％乙醇洗涤一次，13000 rpm离心
10min后干燥。将沉淀溶于200μL水中，4℃保存。
3.3.2 设计引物
SSR标记根据已发表的序列合成(http://www.gramene.org/microsat/ssr.html)。 INDEL标记的设计是根据已发表的粳稻日本晴和籼稻9311两品系的核苷酸序列，将粳稻与籼稻的BAC克隆序列进行比较，在差异序列两侧利用REDB网页设计引物，然后验证在2个亲本粳稻9522和籼稻广陆矮4号之间的多态性。
引物设计的相关网站有
http://redb.ncpgr.cn/modules/redbtools/primer3.php http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://rice.plantbiology.msu.edu/ http://www.arabidopsis.org/ 3.3.3 PCR
PCR程序参考Akaji等人的方法做了部分调整。20μL的PCR反应体系中包括：0.2μM的引物，200μM的dNTP，1×PCR buffer(50mM 的KCl，10mM的 Tris-HCl pH 8.3，1.5 mMMgCl2，0.01%的明胶)，50-100 ng的DNA模板，1U的Taq酶。反应程序为：94℃预变性5min，循环(94℃30s，52℃-54℃30s，72℃30s)38次，最后72℃延伸5min。
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3.3.4 聚丙烯酰胺变性凝胶电泳和银染
采用6％的变性PAGE电泳和银染的方法染色。
PCR扩增产物用6％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳。包括以下三个基本操作步骤：
（1） 制胶：
6％聚丙烯酰胺变性胶的配制方法是：取100 mL 6％丙烯酰胺母液，加入1mL10%的过硫酸胺，70μLTEMED，混匀后立即注胶；注满后，放平玻璃板，插入封条，用夹子夹紧固定。
（2） 点样：
待胶完全凝固后，小心拔出封条，用蒸馏水反复冲洗点样槽，清除多余没有凝固的物质；将玻璃板固定在垂直电泳槽上，加入适量的1×TBE缓冲液，插入梳子；取PCR扩增产物，每管加入3μL含溴酚蓝和二甲苯氰两种指示剂的载样缓冲液，用微量移液器取2-3μL样品注入点样孔。 （3） 电泳：
调电压至1000V，电泳时间约为40min。电泳完毕后，将玻璃板从电泳槽上拆下，取出凝胶，在蒸馏水中漂洗两次，每次约30s；转入0.1%AgN03溶液中，染色10min，不时震荡；然后将凝胶转移到蒸馏水中漂洗两次；最后转入显影液中显色，着色后记录实验结果并用数码相机拍照。 3.3.5 半薄切片
扫描电镜的观察参考Nagasawa等人的方法作了部分调整。半薄切片制备流程如下： （1） 材料固定：FAA固定液固定样品，2小时以上。
（2） 材料脱水：70％，80％，95％乙醇梯度脱水，每级15min。100%--100%乙醇各2h。在
第二次的100%乙醇中加入少许伊红使材料着色。脱水剂体积高于材料的3倍。
（3） 预渗透，时间1-2h。预渗透液：无水乙醇与Basic liquid Technovit 7100等体积混
合。
（4） 渗透，3h—过夜。渗透液：1g硬化剂（1）溶于100mL Basic liquid Technovit 7100 ，
约需15min溶解。
（5） 聚合：1mL硬化剂（2）加到15mL渗透液（即上步操作）的混合液中，混匀后立刻包
埋样品，再于60℃烘箱中烘烤。
（6） 切片并用扫描电镜观察。
4． 实验结果
4.1 雄性不育突变体TF13的遗传分析(此步由实验室完成)
在诱变M2代群体中获得TF13突变体，将其与粳稻9522回交，所有的F1代个体穗部的表型都与野生型一致，说明TF13突变体为隐性核突变体。对其自交获得的F2代群体进行统计，表明该突变性状受单隐性核基因控制。
4.2 在水稻12条染色体上设计标记，筛选多态性分子标记(此步部分由实验室完成)
为了克隆TF13的突变基因，首先要对其进行基因初定位。依据图位克隆原理，需要合成一套分布于水稻各条染色体上的分子标记。根据粳稻、籼稻的测序结果和网上已公布SSR位点(http://www.gramene.org)，合成分布于各条染色体上的SSR标记共308个。筛选到在粳稻9522和籼稻广陆矮4号两个亚种之间存在多态性的标记约100个。
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