发布时间 : 星期二 文章环境工程微生物实验指导更新完毕开始阅读f4a5356083c4bb4cf7ecd15a
环境工程微生物实验指导
实验一 微生物形态观察
一、实验目的
1、认识细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的基本形态特征。 2、巩固显微镜的使用方法。 3、学习微生物画图方法。
二、实验原理
1、细菌的基本形态
细菌是单细胞的微生物，能够独立进行生活，它的种类繁多，但基本形状有四种：球状、杆状、螺旋状和丝状，分别称为：球菌、杆菌、螺旋菌和丝状菌。
（1）球菌：细胞呈球形或椭圆形，根据它们相互联结的形式可以分为单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。如金黄色葡萄球菌。球菌大小以直径表示，一般为0.5~1μm。
（2）杆菌：细胞呈杆状或圆柱形，大小以宽度×长度表示，各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长。如大肠杆菌就比较细而短、枯草杆菌粗而长。
杆菌是细菌中种类最多的，工农业生产中所用的细菌大多是杆菌。
（3）螺旋菌：细胞呈弯曲杆状，螺旋菌细胞壁坚韧较硬，常以单细胞分散存在。大小一般为（0.3~1.0）μm×（1.0~50）μm，根据其弯曲情况可分为弧菌、螺菌、螺旋体。弧菌只有一弯曲，而螺菌有2~6个弯曲。其大小为0.3~1×1~50μm。若菌体弯曲螺旋圈数较多者，无坚韧的细胞壁，比较柔软，能自由运动，通称为螺旋体。
2、细菌的特殊构造
细菌细胞的特殊构造有荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。
（1）荚膜：是有些细菌生活在一定营养条件下，向细胞壁表面分泌的一种粘液状、胶质状的物质。用显微镜观察，中心部位是细菌菌体，在暗色背景下荚膜呈透明状环绕菌体。
（2）鞭毛和菌毛：鞭毛是某些微生物细胞表面着生的一根或数根细长、波曲、毛发状的丝状物。直径为0.1~0.2μm，它是细菌的运动器官。在光学显微镜下不能直接观察到。经过特殊的鞭毛染色后，在光学显微镜下可以看到鞭毛。
（3）芽孢：是某些细菌在其生长的一定阶段，在细胞内形成一个圆形、椭圆形、壁厚、含水量极低、抗逆性极强的休眠体。芽孢形成的位置、形状、大小可因菌种而异。如：枯草芽孢杆菌的芽胞位于菌体中间，呈卵圆形比菌体小；破伤风梭菌芽胞位于菌体一端呈圆形，比菌体大，使菌呈棒锤形。因此，能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊中的位置、大小等特征是细菌鉴定的依据之一。
3、真菌的特征结构
菌丝：是真菌营养体的基本单位。菌丝是一种管状的细丝，用显微镜观察，像一个透明的管，直径一般3~10μm，与酵母菌相似，比细菌和放线菌的细胞直径约粗几倍到几十倍。根据菌丝中是否存在隔膜，可以把真菌菌丝分成两种类型：有隔菌丝和无隔菌丝。无隔菌丝中无隔膜，整个菌丝体就是一个细胞，其中含有多个细胞核，是低等真菌具有的菌丝类型。有隔菌丝有隔膜，菌丝体由多个细胞组成，每个细胞有1个或多个细胞核，是高等真菌具有的菌丝类型。
4、放线菌的特征结构
放线菌是主要呈丝状生长、以孢子进行繁殖、革兰氏染色阳性的一类原核微生物。放线菌的形态比细菌复杂些，但仍属于单细胞微生物。在显微镜下，放线菌呈分枝丝状，我们把
这些细丝一样的结构叫做菌丝，菌丝直径与细菌相似，小于1μm。菌丝细胞的结构与细菌基本相同。
根据菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群，如灰色链霉菌。
三、实验用品
1、器材
（1）普通光学显微镜 （2）细菌装片：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、破伤风梭菌 （3）真菌装片：青霉、黑曲霉、产黄青霉 （4）酵母菌装片：出芽酵母、酿酒酵母 （5）放线菌装片：灰色链霉菌
2、试剂和材料
（1）擦镜纸，（2）香波油，（3）二甲苯。
四、实验方法与步骤
1、细菌基本形态观察
（1）显微镜下观察细菌三型装片，金黄色葡萄球菌装片，注意菌体间的关系。 （2）显微镜下观察枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的装片。 （3）显微镜下观察螺旋菌装片，注意菌体的螺旋。 2、细菌特殊构造观察
（1）油镜下观察固氮菌装片：注意观察荚膜的位置、形态以及与菌体的关系；注意荚膜与菌体的染色差异，染色后，菌体呈黑色，荚膜无色。（2）油镜下观察大肠杆菌装片：注意鞭毛的染色位置数目形状和大小。（3）油镜下观察枯草芽孢杆菌及破伤风梭菌装片；注意芽孢和菌体染色的差别，芽孢的形态大小和位置。
3、真菌的特征结构观察
观察青霉、黑曲霉装片，注意观察它们的分生孢子形状，组成等。 4、酵母菌的形态观察
观察出芽酵母形状和出芽方式。 5、放线菌的形态观察
五、思考题
1、画一圆圈表示视野，选取一些有代表性的微生物画图，注意特殊构造形状和排列方式。颜色深的可用点的密度来表示，不可涂抹，标注所观察的菌种名称，放大倍数和特殊结构。
2、细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的细胞大小细胞形态有何区别？
实验二 微生物染色
一、实验目的
1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。 2、巩固显微镜的使用方法。
3、了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
二、实验原理
虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰
地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等。因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
1、细菌的简单染色法
所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，易于在显微镜下进行观察。
染色前必须先固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体黏附于载玻片上，二是增加菌体对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
2、革兰氏染色法
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要依据。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。
三、实验用品
1、器材
（1）显微镜 （2）酒精灯 （3）载玻片 （4）接种环 （5）双层瓶 （6）擦镜纸 （7）试管夹 （8）二甲苯 （9）香柏油 （10）吸水纸 （11）染色缸
2、试剂和材料
（1）吕氏碱性美蓝染色液，（2）石炭酸复红染色液，（3）草酸铵结晶紫染色液 （4）路哥尔氏碘液，（5）95%乙醇，（6）复红染色液，（7）生理盐水，（8）菌种
四、实验方法与步骤
1、细菌的简单染色法
（1）涂片 取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作，分别挑取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌于二载玻片的水滴中，调匀并涂成薄膜（挑菌宜少，涂片要薄，过厚不易观察）。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。
（2）干燥 于室温下自然干燥。
（3）固定 涂片面向上，于火焰上通过2~3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。
（4）染色 放标本于水平位置，滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。吕氏碱性美蓝染色液约染2~3分钟，石炭酸复红染色液约染1~2分钟。
（5）水洗 染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。
（6）镜检 置于显微镜下观察。
（7）清理 实验完毕，清洁显微镜和玻片。
2、革兰氏染色法 （1）涂片
将培养14~16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰2~3次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）染色
① 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约1min，水洗。 ② 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
③ 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20~30秒钟，立即用水冲净酒精。
④ 复染 用番红液染1~2min，水洗。
（3）镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
（4）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
（5）清理 实验完毕，清洁显微镜和玻片。
五、思考题
1、绘出你所观察到的经单染的两种细菌形态图。
2、在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？
3、根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？ 4、制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
5、作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？
实验三 微生物细胞计数
一、实验目的
1、明确血球计数板的构造及计数的原理。 2、学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。 二、实验原理
如果要区分计数样品中的活菌和死菌，可以采用微生物的活体染色，然后计数。微生物的活体染色就是采用对微生物无毒的染料（如美蓝、中性红等）配成一定的浓度，在与一定量的菌液混合，经过一段时间后，活菌和死菌会呈现不同的颜色，这样就可以在显微镜下区分活菌和死菌。
美蓝是常用的活体染色染料，它处于氧化态时呈蓝色，还原态时无色。用美蓝进行活体染色时，由于活细胞代谢过程中的脱氢作用，美蓝接受氢后由氧化态变为还原态，因此活细胞无色，而衰老或死亡的细胞由于代谢缓慢或停止，不能还原美蓝，因此细胞呈淡蓝色或蓝色。
三、实验用品
1、器材