发布时间 : 星期一 文章环境工程微生物实验指导更新完毕开始阅读f4a5356083c4bb4cf7ecd15a
2、做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？ 3、灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？ 4、高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？
5．高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到0时才能打开排气阀，开盖取物？
实验五 水中细菌总数测定
一、实验目的
1、学习并掌握水样采集和水中细菌总数测定的方法。 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水中的重要性。
二、实验原理
水中细菌总数可以作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。细菌数量越多，则水中有机质含量越高。在水质卫生学检验中，细菌总数是指1mL水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中经37℃、24ｈ培养后所生长出的细菌菌落数。我国规定1mL自来水中细菌总数不得超过100个。
本实验采用平板菌落计数法测定水中细菌总数。
平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及水源的污染程度的检定等。
三、实验用品
1、器材
（1）无菌平皿 （2）1ml无菌吸管 （3）试管架 （4）记号笔 （5）盛有9ml无菌水的试管 （6）微量移液器 （7）吸液头 （8）带玻璃塞的三角瓶 （9）恒温培养箱 （10）超净工作台 （11）酒精灯 2、试剂和材料
（1）牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂10~15g，蒸馏水1000mL，pH 7.2
四、实验方法与步骤
1、水样采集和保藏
（1）自来水：先将水龙头用火焰灼烧3min灭菌，然后再放水5~10min，最后用无菌容器接取水样，并迅速送回实验室检测（较清洁的水可在12h内测定）。
（2）池水、河水、湖水：将无菌的带玻璃塞瓶瓶口向下浸入距水面10~15cm的深层水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，当取完水样后，即将瓶塞塞好（注意：采样瓶内水面和瓶塞底部可以留些空隙，以便在测定时可充分摇匀水样），再从水中取出。然后迅速送回实验室检测（污水须在6h内完成测定）。
2、水中细菌总数测定
（1）自来水：用无菌移液管吸取1mL水样，加入无菌培养皿中（每个水样重复2个培养皿），然后在每个上述培养皿内各加入约15mL已融化并冷却至45~50℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并轻轻旋转摇动，使水样与培养基充分混匀，冷凝后即成检测平板。取另一平皿，只加培养基，不加水样，作为空白对照。然后将检测平板和空白对照平板倒置于37℃恒温箱
中培养24h后计数。
（2）池水、河水、湖水： ① 编号：
取无菌平皿 9套，分别用记号笔标明10-1、10-2、10-3各2套。另取6支盛有9ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
② 稀释水样
用1mL无菌吸管精确地吸取1ml待测水样放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸1mL放入10-2试管中，吸吹三次，其余依次类推，稀释至10-5或10-6（稀释倍数视水样污染程度而定，以培养皿上长出的菌落数在30~300之间的稀释度最为合适，若3个稀释度的菌落数多或者少到无法计数，则需继续稀释或减少稀释倍数）。
③ 加样
用3支1mL无菌吸管分别精确地吸取10-1、10-2、10-3的稀释菌液1mL，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一稀释度重复2个培养皿。
④ 加入融化培养基
于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约15mL，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培养。
3、平板菌落计数
培养24小时后，取出培养皿，用肉眼观察，然后按下述步骤计算同一稀释度二个平皿上的菌落平均数。
（1）首先选择平均菌落数在30~300之间的进行计算，当只有一个稀释度的平均值符合此范围时，则以该平均菌落数乘以稀释倍数即为该水样的细菌总数。
（2）若有两个稀释度，其平均菌落数均在30~300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若比值小于2，应取两者的平均数，若大于2，则取其中较小的菌落总数。
（3）若所有稀释度的平均值均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。 （4）若所有稀释度的平均值均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。 （5）若所有稀释度的平均值均不在30~300之间，则以最近300或30 的平均菌落数乘以稀释倍数。
（6）若同一稀释度的两个平板上，其中一个平板有较大片状菌苔生长，则该平板的数据不予采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数，若片状菌苔大小不到平板的一半，而其余一半菌落分布又很均匀，则可将此一半的菌落数乘以2来表示整个平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
五、思考题
1、记录计数结果。
2、通过对自来水样品中细菌总数的测定，你认为此样品是否符合国家饮用水的卫生标准？若结果超标，请分析原因？
3、你所检测的水源的水污染情况如何？通过实验你对保护水源水有何认识？ 4、水质的细菌学检查有何意义？