发布时间 : 星期一 文章分子诊断试卷 两份更新完毕开始阅读f73532394b73f242336c5f5c
GGTCAAT和GGGCCC序列, 称为GC box, 它们经协同作用,以调控基因的转录效率。
启动子的转录效率因细胞而异，因此需要根据宿主细胞的类型选择不同的启动子，以便真核基因的高效表达。常用的启动子有Rous肉瘤病毒启动子RSV和巨细胞病毒的启动子CMV。还有SV40早期启动子, 腺病毒的晚期启动子。
⑵ 增强子
增强子是使启动子的基因转录效率显著提高（增强转录活性）的一类顺式作用元件，其本身不具有启动子活性，是由多个独立的，具有特征性的核苷酸序列所组成。其基本的核心组件常由812bp组成, 以单拷贝或多拷贝串联的形式存在。增强子一般有以下特性：⑴增强子能提高同一条DNA链上基因转录的速率;⑵增强子对同源或异源基因都有效; ⑶增强子的位置可在基因5'上游、3'下游或内部; ⑷无方向性,增强子从5'→3'或是从3'→5'均可对启动子发挥作用; ⑸增强子可远离转录起始点; ⑹增强子一般无基因特异性, 对各种基因启动子均有作用, 但具有组织或细胞特异性。
典型的增强子首先发现于SV40的病毒中, 为SV40的早期基因增强子, 约200bp, 含2个72bp的重复序列, 位于早期启动子上游, 增强子可促使病毒基因转录效率提高100倍，因此具有这一增强子的载体已得到了广泛的应用。近些年来，来自于Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列和人类巨细胞病毒（CMV）增强子也已被广泛用于真核细胞的基因表达。
增强子能增强启动子的转录能力，有效的增强子能促进转录达10倍或100倍以上, 在某些情况下, 表达产物可能具有细胞毒效应。因此，最好使用一种可被外界刺激信号诱导表达外源基因的诱导型启动子, 诱导型启动子有热休克启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激和固醇类激素诱导的启动子，热休克启动子的诱导可通过提高细胞的培养温度使启动子转录水平提高，重金属离子可有效地促进金属硫蛋白启动子的转录活性。
⑶ RNA剪接信号
多数高等的真核基因都含有内含子序列, 在细胞核内转录产生的前体mRNA要经过剪接过程去掉内含子顺序后才成为成熟的mRNA分子。虽然许多基因的cDNA转入哺乳类动物细胞后, 其表达不受有或无内含子的影响, 但有些基因在真核细胞中表达需要有内含子的存在。一般来说，在哺乳动物细胞的表达载体中最好有一段内含子序列的剪接信号，以提供外源基因cDNA表达的需要。常用的内含子剪接序列有SV40的小t抗原的内含子序列等。
⑷ 负调控元件
沉默子和衰减子是抑制基因转录的DNA序列, 称为负调控元件, 它们与反式作用因子相互结合而起作用。这些负调控元件不受距离和方向的限制，并可对异源基因表达起作用。
⑸ 终止子和polyA信号
真核基因转录的确切终止信号和终止机制, 目前尚不清楚, 终止过程不是在RNA聚合酶指导下完成的, 在不明机制下发生转录终止。现在已发现模板DNA分子的3'端有转录终止信号序列, 称终止子。通常由转录产生的具有polyA尾的基因终止信号是在多聚腺苷酸化位
点下游的一段长度为数百个碱基的DNA区域内的G/T簇, 例如在SV40中的AGGTTTTTT的DNA序列为终止转录调控元件。一般转录终止子为发夹结构的反向重复序列。现在基因工程表达载体上所使用的转录终止子都是病毒基因或细胞基因的3'端的一段序列, 其中也包括3'端不翻译区。如SV40小t抗原和β-球蛋白的转录终止片段常用于构建真核基因表达载体。
一般认为polyA的存在增加了mRNA分子的稳定性,使之能成功地进行翻译。准确而有效地进行多聚腺苷酸化需要两种序列：⑴位于polyA位点下游的GU丰富区或U丰富区; ⑵位于polyA位点上游的11～30个核苷酸处的一个由6个核苷酸组成的高度保守序列（5'-AAUAAA）, 这些序列与转录后的RNA切割和加尾有关。最常用的polyA信号是用SV40的一段237kb的BamHI-BcLI酶切片段, 它包含早期和晚期转录单位的切割和加polyA信号, 两套信号分别位于不同的DNA链上, 作用方向相反, 它们对mRNA的加工都同样有效。
在双启动子的表达载体中，启动子的转录方向为同向时，上游启动的转录由于会穿过下游启动子，这样就使得下游的转录受到极大的影响，造成下游转录水平的下降，但是如果在两个启动子间插入一个转录终止子后，上游启动子对下游启动子的影响就被消除了，这样下游启动子的表达量会有明显提高。当两个启动转录方向相反时，基因表达可能会被转录形成的反义RNA所抑制, 这时插入转录终止子将会消除这种抑制作用。
4. 基因工程疫苗研究开发应遵循的原则是什么？（8分）
答：(1)不能或难于培养的的病原体如乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，戊型肝炎病毒(HEV)，EB病毒(Epstein-Barr病毒，EBV)，巨细胞病毒(CMV)，人乳头瘤病毒(HPV)，麻风杆菌，疾原虫、血吸虫等。
(2)有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体，前者如1型嗜人T淋巴细胞病毒(HTLV-I)，人免疫缺损病毒(HIV),单纯疱疹病毒(HSV)，还有EBV、CMV、HPV等。后者如呼吸道合胞病毒(RSV),登革热病毒(DGV)，肾综合征出血热病毒(HFRSV)；
(3)常规疫苗免疫效果差，如霍乱和痢疾菌苗；或者反应大，如百日咳和伤寒菌苗。 (4)能大大节约成本，简化免疫程序的多价疫苗，如以痘苗病毒，腺病毒，卡介苗或沙门氏菌为载体的多价活疫菌；
5. 有哪几种反义核苷酸基因失活疗法？简述其原理。（9分）
答：（1）将特异的反义基因重组到表达载体上（病态载体或质粒），导入靶细胞中转录出反义RNA，形成双链RNA（RNA/RNA双链体），阻碍基因的翻译。（2）人工合成寡聚脱氧核糖核酸（ODN）经过化学修饰导入细胞，与mRNA和DNA结合，形成RNA/DNA杂链或DNA核苷酸三聚体，影响基因的翻译或转录。（3）特异性的核酶，根据癌基因设计出特异的“锤头”或“发夹”结构，它能够催化切割，降解异常表达基因的mRNA而影响基因的翻译。
分子诊断学试卷B
适用专业及层次（由出卷教研室填写）：
班级________________ 姓名________________ 学号___________________
（此试卷共3页，答案请填写在答题纸上，答案填写在试卷上者答题无效）
一、名词解释（每题2分，共20分;请将答案填写在答题纸上）
1. 转化
2. 质粒不亲和性 3. cDNA文库 4. RACE: 5. 基因文库 6. RT-PCR 7. 载体: 8. S-D序列
9.&.bsp; 穿梭质粒载体 10. MCS
二、选择题（每题1分，共15分; 请将答案填写在答题纸上） 1. 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是( )。 A.修复自身的遗传缺陷B.促进自身的基因重组 C.强化自身的核酸代谢D.提高自身的防御能力 2. 生物工程的下游技术是( )。
A.基因工程及分离工程B. 蛋白质工程及发酵工程 C.基因工程及蛋白质工程 D.分离工程及蛋白质工程
3. 基因工程操作常用的酶是:(I 内切酶II 连接酶III 末端转移酶IV聚合酶( )。 A. I + II B. I + III + IV C. II + III + IV D. I +II + IV + III 4. 限制性内切核酸酶的星活性是指( )。
A. 在非常规条件下，识别和切割序列也不发生变化的活性。 B. 活性大大提高
C. 切割速度大大加快
D.识别序列与原来的完全不同
5. 下列五个 DNA 片段中含有回文结构的是( )。
A. GAAACTGCTTTGAC B. GAAACTGGAAACTG C. GAAACTGGTCAAAG D. GAAACTGCAGTTTC 6. 关于cDNA的不正确的提法是( )。
A.同mRNA互补的单链RNA
B.同mRNA互补的含有内含子的DNA C.以mRNA为模板合成的双链RNA D.以上都不正确
7. 下列有关连接反应的叙述，错误的是( )。 A. 连接反应的最佳温度为 37 ℃
B. 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于 10%
C. 连接反应缓冲体系的 ATP 浓度不能高于 1mM D. 连接酶通常应过量 2-5 倍
8. T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是( )。
A. 2' -OH 和 5' –P B. 2' -OH 和 3' -P C. 3' -OH 和 5' –P D. 5' -OH 和 3' -P 9. 载体的功能是( )。
A. 外源基因进入受体的搭载工具 B. 不能为外源基因提供整合能力 C. 不能提供复制能力
D. 不能为外源基因提供表达能力
10. 黏性末端连接法，不仅操作方便，而且( )。 A.产生新切点B.易于回收外源片段 C.载体不易环化D.影响外源基因的表达
11. 下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大? ( ) A.质粒B.黏粒C.酵母人工染色体(YAC) D.λ噬菌体 12. 考斯质粒（cosmid）是一种( )。
A.容量最大一种载体B.由λ -DNA 的 cos 区与一质粒重组而成的载体 C.是一种单链DNA环状载体D.不能在受体细胞内复制，但可以表达
13. 13 ( )某一重组 DNA 的载体部分有两个 BamHI 酶切位点。用 BamHI酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子，其长度总和与已知数据吻合，该重组分子插入片段上的 BamHI 酶切位点共有( )。 A.4 个B. 3 个C. 1 个D. 2 个
14. 下列哪一种酶作用时需要引物? ( )
A.限制酶B.末端转移酶C.反转录酶D. DNA连接酶
15. 用下列方法进行重组体的筛选，只有( )说明外源基因进行了表达。 A.Southem印迹杂交B.Northem印迹杂交 C.Western印迹D.原位菌落杂交
三、简答题（每题5分，共25分; 请将答案填写在答题纸上） 1. 什么是包涵体？
2. 什么是α-互补筛选？
3. 简述酶切反应体系及反应条件？ 4. 核酸操作的基本技术有哪些？
5. 基因工程诞生的理论基础是什么？
四、论述题（每题10分，共40分; 请将答案填写在答题纸上） 1. 如何有效地提高外源基因的表达效率？ 2. 试述载体构建一般方法。
3. 试述5′RACE技术原理和方法
4. 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？
答案-试卷B
一、名词解释（每题2分，共20分）
1. 转化： 严格地说是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。 2. 质粒不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳
定地共存的现象。