发布时间 : 星期日 文章分子诊断试卷 两份更新完毕开始阅读f73532394b73f242336c5f5c
3. cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克
隆的集合。
4. RACE：是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成
，，
cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3或5端之间未知序列的方法。 5. 基因文库：通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物，组织，器官或细胞类型的所有
DNA片段而构成的克隆集合体。
6. RT-PCR:先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为引物合成cDNA第一链，然后用已知
一对引物，扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录PCR。
7. 载体：指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的运载工具，它的本质是DNA复制子。 8.S-D序列：在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核
，
糖体RNA 3末端碱基互补的序列，该序列最初由Shine 、Dalgarno发现，故后来命名为Shine-Dalgarno 序列，简称S-D序列。
9. 穿梭质粒载体：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种
不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。
10.MCS：指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片
段。
二、选择题（每题1分，共15分）
题号 答案 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 D A A D D C A C D C C B D C C 三、简答题（共25分，每题5分）
1. 什么是包涵体？
答：重组蛋白在胞内表达时，常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶状体即包涵体。包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象，这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合，而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。 2. 什么是α-互补筛选？
答：质粒载体具有β-半乳糖苷酶基因（lacZ），当外源DNA插入到它的lacZ，可造成表达后的β-半乳糖苷酶失活，利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。有些大肠杆菌上带有lacZ基因的部分编码序列，质粒载体中含有别一部分编码序列，当质粒转入载体后，可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫α互补。
3. 限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？
答：⑴酶的纯度。 ⑵DNA样品的纯度。 ⑶DNA的甲基化程度。 ⑷酶切反应的温度与时间。 ⑸DNA分子的构型。
⑹限制性核酸内切酶的反应缓冲液。 4. 核酸操作的基本技术有哪些？
答：①核酸提取与纯化②核酸的检测与保存③核酸的凝胶电泳④核酸分子杂交 5.基因工程诞生的理论基础是什么？
答：是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。 理论上的三大发现：
①证实了DNA是遗传物质
②揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理 ③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定 技术上的三大发明：
①限制核酸内切酶的发现与DNA切割 ②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接 ③基因工程载体的研究与应用
四、论述题（每题10分，共40分）
1. 如何有效地提高外源基因的表达效率？
答：⑴提高启动子强度⑵缩短启动子同克隆基因间距离⑶高效的翻译起始序列⑷高效的转录终止区⑸提高质粒拷贝数及稳定性 ⑹用以下方法提高翻译水平：①调整SD序列与AUG间的距离②用点突变的方法改变某些碱基③增加mRNA的稳定性的 ⑺减轻细胞的代谢负荷：①诱导表达②表达载体的诱导复制 ⑻提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：①克隆一段原核序列，表达融合蛋白②采用某种突变菌株③表达分泌蛋白质 2. 试述载体构建一般方法。
答：A 目的基因分析（1）ORF 分析（2）酶切位点分析
B 载体选择与分析（1）多克隆位点分析（2）抗性标记分析（3）启动子与其他筛选标记分析
C 连接体系与连接时间确定
3. 试述5′RACE技术原理和方法答：PCR用于扩增代表mRNA转录物某一单位点与其3′或
5′末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术（RACE）。如果已知mRNA的一片段链内短序列，据此或设计基因特异引物，用原先存在的poly(A)尾（3′末端）或附加的同聚尾（5′末端）互补的序列做末端引物，就可以获得从未知末端直到已知区域的部分cDNA序列。为获得5′末端部分cDNA克隆需用基因特异引物，产物第一链产物，可用末端脱氧核苷酸转移酶及dATP加poly(A)尾。通过QT引物和反转录使用的上游基因特异引物生成第二链cDNA。
4. 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？
答：优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。
缺点：在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。