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生 物 化 学 实 验 讲义 双缩脲（ml） OD540 蛋白质浓度（mg/ml） 3 0 3 0.8 3 1.6 3 2.4 3 3.2 3 4 上述各管试剂混匀后，室内温静止20~30min 后于540nm处比色，以第一管作为空白对照管。以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标，作蛋白质与OD的标准曲线图。 2、知浓度酪蛋白样品测定：
取未知浓度样品1ml，加水补至2ml，再加4ml双缩脲试剂，混匀后，静止20~30min,于540nm处比色。根据蛋白质与OD标准曲线图，计算样品中酪蛋白的含量。
3、蛋白纯度鉴定：
纯度（%）=样品中酪蛋白实测量（mg）/添加酪蛋白量（mg）×100%
五、
结果与讨论
物理法：射率法、比浊法、放射性同位素法 利用共性 凯氏法
蛋白质定量法 双缩脲法：比色法
Lowry法
利用特定氨基酸残基 紫外法 比色法 色素结合法
蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农副产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。蛋白质定量的意义是：测定或算出一定数量或容量的样品中所含蛋白质成分的数量。
现有的多种蛋白质定量法，都是根据蛋白质分子的理化性质进行的。这些方法大体可分为利用蛋白质药共性（含氮量、肽键、折射率等）和利用蛋白质含有特定氨基酸残基（芳香族、酸性、碱性等）两类。
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实验七 紫外吸收法测定蛋白质的含量
一、 目的要求
1、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理和操作。 2、了解紫外分光光度计的原理及使用方法。 二、 原理
由于蛋白质分子结构中具有芳香族氨基酸（如色氨酸、苯丙氨酸和和酪氨酸）残基，因此，对280nm的紫外光有最大吸收，而且280nm的吸收值与蛋白质溶液的浓度成正比，可用于蛋白质的定量测定。 三、 材料 （一）试剂
1、标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的蛋白质（酪蛋白或牛血清白蛋白），用蒸馏水精确稀释成1mg/ml的浓度。
2、样品液：浓度为1mg/ml左右的酪蛋白溶液（配制2mg/ml）。 （二）器材
1、紫外分光光度计；试管；吸管 四、 实验方法
1、标准曲线的绘制
取五支试管编号，按下表加下各试剂：
管号
标准蛋白质溶液（ml）
蒸馏水（ml） 蛋白质浓度（mg/ml）
1 0 4.0 0
2 1.0 3.0 0.25
3 2.0 2.0 0.5
4 3.0 1.0 0.75
5 4.0 0 1.0
试剂加完后混匀，在紫外分光光度计上于280nm处测定其OD值，作OD值-蛋白质浓度曲线。 2、样品测定
取待测蛋白质样品1.0ml，加蒸馏水3.0ml在波长280nm处测OD值，从标准曲线上查其浓度。
五、 结果讨论
1、紫外吸收法可测定0.1~0.5mg/ml的蛋白质溶液，该法迅速、简单，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用，特别是在柱层析分离
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中，利用280nm进行紫外检测来判断蛋白质吸附或洗脱情况最常用的方法。 2、对于测定那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
3、核酸在280nm处也有吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定260nm处的吸收值，通过计算就可以消除其对蛋白质测定的影响，不过因不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过计算校正，测定结果还存在着一定的误差。
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实验八 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
一、 实验目的
学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。 二、 实验原理
蛋白质是两性电解质，在溶液的pH
电泳方法主要：1）自由界面电泳（将蛋白质溶于缓冲液中通过进行电泳）；2）区带电泳（将蛋白质溶液点在浸含有缓冲液的支持物上进行的电泳）。区带电泳又可根据支持物的性质进行分类：纸电泳、薄膜电泳（醋酸纤维薄膜和聚酰胺薄膜）、凝胶电泳（琼脂糖凝胶——分离核酸、聚丙烯酰胺凝胶——分离蛋白质和寡核苷酸等）、粉末电泳（淀粉、纤维素粉或硅胶粉等）、细丝电泳（尼龙丝和其他人造丝电泳）。
醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。
醋酸纤维薄膜由醋酸纤维素制成（醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化而得，将其溶于有机溶剂如丙酮、氯仿、氯乙烯、醋酸乙酯等后，涂抹成均一薄膜，即为醋酸纤维素薄膜），它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120μm，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。
血清中含有数种不同的蛋白质，血清中含有多种蛋白质：有四种球蛋白即α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白；一种清蛋白。由于它们的分子量各异，所带电荷不等，因而在电场中移动速度各不相同，可以利用醋酸纤维薄膜作为支持物进行电泳将它们分开。
血清各蛋白质的分子量： 血清组分 分子量（MW） pI 清蛋白 69000 4.64 α1球蛋白 200000 5.06 α2球蛋白 300000 5.06 β球蛋白 9万~15万 5.12 γ球蛋白 15.6万 6.35~7.30 电泳所用的缓冲溶液是巴比妥缓冲液（pH8.6），因此各种蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动。
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