发布时间 : 星期四 文章细胞组织切片及观测方法(实验教材)更新完毕开始阅读fd497cd576eeaeaad1f330bf
四、脱水：就是用一种药剂把材料中的水份全部代替干净。
（一）脱水原因：在制作永久制片时，组织冲洗完毕后必须进行脱水，因组织固定和水洗后含大量水分，而水不能和石蜡包埋剂混合，组织内只要有极少量水份，就会防碍包埋剂的渗入。
第一步脱水：是为了引入包埋剂作准备。 第二步脱水：是为了引入封藏剂作准备。 （二）脱水的结果：
使材料变硬，形状更加稳定，利于组织永久保存。除尽材料的水份，才能使透明剂、包埋剂、封藏剂渗透到组织中，有利于组织的透明和透蜡。 （三）脱水的方法：
脱水应逐步进行，而不能骤然进行，否则会引起组织的强烈收缩，或使材料变形。一般把脱水剂配成各种浓度，材料自低浓度到高浓度依次经各级脱水剂，其中所含水份逐渐被脱水剂取代。
（四）脱水剂应具备的两个特性：
1.必须是亲水性，能与水以任何比例混合，代替细胞中的水份。 2.必须能和其他有机溶剂混溶取代。 （五）脱水剂分为两类：
1.非石蜡溶剂的脱水剂：如乙醇、丙酮等，组织脱水后必须经二甲苯透明才可浸蜡。 2.石蜡溶剂的脱水剂：如正丁醇、二氧六圜等，组织脱水后即可直接透蜡，不需经过中间溶剂二甲苯之类的药品。 （六）常用的脱水剂： 1.乙醇：
（1）按浓度梯度依次进行15%→35%→50%→70%→83%→95%→100%→100%； （2）脱水时的注意事项：
①脱水必须要在有瓶盖内进行，尤其是高浓度乙醇很容易吸收空气中的水份。 ②组织由低浓度向高浓度的乙醇转移时，要用吸水纸吸干余液，以免将水份带入。 ③纯乙醇中如有水，可加无水硫酸铜以吸去水份。 （3）在各级停留的时间：
第一步脱水，须看材料的性质大小而定，体积为2mm3的一般每级为1-4小时； 第二步切片脱水，每级只需3-10min；在低浓度酒精中，每级停留的时间不易过长，否则易使组织变软，助长材料解体。从95%到100%乙醇后，时间不能太长，否则材料变
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硬变脆，影响切片。为使乙醇脱水彻底，应更换两次100%乙醇。如需过夜应停留在70%酒精中。
注：在每级中停留的时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。
①如洋葱、蚕豆等根尖和小片叶子一样大小的材料，每级停留约30min-1h。若用苦味酸固定则可延长为1h。
②由FAA固定的草本茎，每级停留2小时，木本茎停留4小时，较大的木材每级延长为8-12小时。
③一般动物组织如小白鼠的肾脏2-4mm厚，每级停留1-2h。
④脱水至纯酒精时，需更换两次，每次30min-1h；材料大者，可多换一次。由95%-100%时，瓶子上的塞子也应换干燥的，以免水份渗入。
2.丙酮：为很好的脱水剂，可以代替乙醇，其作用和用法和乙醇相似，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。能使蛋白沉淀，组织硬化，不能溶解石蜡，所以仍需经过二甲苯或其他透明剂，然后才能进行浸蜡和包埋。
3.正丁醇：此剂易挥发，可与水和乙醇混合，亦是石蜡溶剂，可不经透明剂直接浸蜡。但一般在应用上还未能完全替代乙醇。多与乙醇按一定比例混合作脱水之用，但最后需经纯正定醇方可浸蜡。很少引起组织块的收缩，变脆。
级别 蒸馏水 乙醇 正丁醇
表1-5各级浓度的正丁醇： Ⅰ（ml） Ⅱ（ml） Ⅲ（ml） Ⅳ（ml） Ⅴ（ml） Ⅵ（ml） 50 30 15 5 0 0 40 50 50 40 25 0 10 20 35 55 75 100 18
Ⅰ-Ⅳ中的乙醇可用95%，仅Ⅴ级的用纯乙醇配。Ⅱ中可过夜。材料经两次正丁醇后，进入1/2正丁醇1/2石蜡，经1-3小时后，转入纯石蜡。
4.叔丁醇:可与水，乙醇及二甲苯等剂混合，(可套用上表)也可单独使用，是一种应用很广的脱水剂。此液不会使组织收缩或变硬，不必经过透明，可直接浸蜡。应用此剂可以简化脱水、透明等步骤。因此已逐渐代替乙醇，但价格较贵。
表1-6各级浓度的叔丁醇：
级别 Ⅰ（ml） Ⅱ（ml） Ⅲ（ml） Ⅳ（ml） Ⅴ（ml） Ⅵ（ml） 蒸馏水 40 30 15 0 0 0 乙醇 50 50 50 50 25 0 正丁醇 10 20 35 50 75 100 Ⅰ-Ⅳ中的乙醇可用95%，仅Ⅴ级的用纯乙醇配。材料经两次叔丁醇后，进入1/2叔丁醇1/2石蜡，经1-3小时后，转入纯石蜡。
举例：植物骨架光镜观察的实验中，若遇到效果好的片子，可通过以下步骤做成永久切片：50%乙醇→70%→95%→1/295%：1/2叔丁醇→叔丁醇→中性树胶（每级5-10min）。
5.甘油，也是一种良好的脱水剂，尤其对细小柔软的材料更适合。用甘油脱水可以避免原生质收缩，但脱水前必须洗净固定剂，以免影响包埋和染色。利用甘油脱水，可以从50%浓度开始至纯甘油，再换纯乙醇。
6.二氧六环：为无色液体，易挥发燃烧，且有毒，应尽力避免吸入它的蒸气。能与水和乙醇在任何比例下混合，为石蜡溶剂，脱水至纯二氧六环后，即可进行包埋。浓度梯度设计为：30%→50%→70%→90%→100%→100%→100%每级时间为1-6小时。 五、透明：
材料经脱水剂去水分后，还要经过一种既能与脱水剂，又能与包埋剂相混合的溶剂—透明剂来处理，以便于包埋剂的深入或封藏。在制片过程中有两次透明：第一次是组织块的透明，为了引入包埋剂。第二次是染色以后切片的透明。为了引入封藏剂。 （一）常用透明剂：透明剂都是石蜡的溶剂，绝大多数不能与水混合，最常用的透明剂有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，冬青油等。
1.二甲苯：目前应用最广。易溶于乙醇，又能够溶解石蜡，加拿大树胶，透明力强，作用较快。其最大缺点是容易变硬变脆.材料必须脱尽水分再透明，否则发生乳状浑浊。
在玻片进入二甲苯前，为了减少材料收缩，材料先经过1/2二甲苯+1/2无水乙醇→二甲苯（I）→二甲苯（II）→1/2二甲苯+1/2石蜡
材料在二甲苯中时间不宜过长，否则材料收缩变硬，变脆。一般组织块透明总时间1-3小时，（每级30分钟左右）染色后的切片透明每级5-10分钟。
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2.甲苯：性质同二甲苯，可作为二甲苯的替代品，但甲苯的透明较慢，一般需12-24小时，材料不变脆，故此点优于二甲苯。
3.苯：性质近似二甲苯，挥发较快，且易爆炸，人吸入苯能引起中毒。使组织收缩较小，久浸也不像二甲苯使组织产生脆硬现象。
4.氯仿：也是一种很好的透明剂，组织透明时收缩不太厉害，不变脆，易挥发，浸透力比二甲苯，苯慢，透明时间比二甲苯应延长2-3倍。氯仿适用透明大块组织，火棉胶切片和植物石蜡切片。 六、浸蜡与包埋：
组织经过透明后要让石蜡支持剂透入内部使它变硬，并将组织包埋进去，把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成薄片。以利于切片和观察，这个过程将为“浸蜡”和“包埋”。
（一）常用包埋剂
1.石蜡的熔点多为50-60℃。选用不同熔点的石蜡的原则：
（1）石蜡硬度与组织硬度相近似，组织较硬时，用硬的石蜡，反之用软的石蜡。一般动物材料石蜡的熔点为52-56℃，植物材料石蜡的熔点为54-58℃。 （2）切片较薄时（4um以下），石蜡的熔点为58-60℃.
（3）最重要的要看室内温度，通常在夏天用熔点高的石蜡-硬蜡，冬天用熔点低的石蜡-软蜡。石蜡太硬，切片时容易破碎，不易切成腊带，太软时，蜡带容易皱缩。
2.火棉胶 为固体胶片，市售的有的是胶片，有的是已配成6%或4%的溶液，即取6g或4g火棉胶片溶于100ml乙醚和乙醇的等量混合液中。配制时，先将火棉胶浸于乙醇中，12-24小时后在加入等量乙醚，这样溶解较快。）
（二）浸蜡：材料经透明后，倒入二甲苯，再在上面倒入60℃的石蜡，使石蜡：二甲苯=3：2；放在35-37℃的恒温箱中浸蜡1-2天。将温箱升至60℃，将石蜡和二甲苯倒出，换纯石蜡两次，每次1小时。
（三）包埋：准备烫板、纸盒、成冰水的盆、酒精灯和解剖针。
步骤：纸盒放于烫板上，将石蜡和材料一起倒出，用加温后的解剖针将材料调到合适的位臵，标签有文字的一面向下。再补足石蜡。轻轻提起纸盒的两侧的把手，慢慢平放于盆的水面上，待纸盒内石蜡表面已凝固，即可将纸盒向一侧倾斜，使其立即进入冷水中，迅速凝固，经30min-1h后，取出晾干。 七、切片：
石蜡切片，用旋转切片机。如图1-4所示。一个旋转切片机，可分三个部分，一个
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