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子信号如血管紧张素受体I（AT1）、AP-1、核转录因子NF-ΚB、碱性成纤维细胞生长因子bFGF的mRNA和蛋白表达及活性的变化，确定relaxin抑制RAAS诱导心肌纤维化的分子靶点。
4、在上述研究的基础上，进一步观察relaxin抑制心肌纤维化的细胞内信号转导机制。在原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，分别利用腺苷酸环化酶（adenyl cyclase,AC）、PKA、过酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase, PDE）、Erk1/2及PI3K/Akt的激动剂和拮抗剂，以上述试验中确定的靶分子的表达和活性的变化为指标，确定relaxin抑制心肌纤维化的信号转导机制。
拟解决的关键问题：
确证Relaxin为机体抗纤维化的内源性防御体系，探讨relaxin抗心肌纤维化的机制及分子信号转导通路。（1）在整体、离体的纤维化模型上，观察内源性relaxin及其受体的变化，及外源性补充relaxin的抗心肌纤维化效应。（2）确定relaxin抗心肌纤维化的作用靶点及相应的信号通路。（3）确定relaxin对心肌RAAS系统的影响及其抑制RAAS作用的分子靶点。
3．拟采取的研究方案及可行性分析 拟采取的研究方案
1、确定relaxin的抗心肌纤维化作用，筛选其作用的靶分子。 大鼠腹腔注射ISO诱导大鼠亚急性心衰，大鼠腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心衰，分别复制修复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化的模型。通过组织切片、天狼星红染色观察心肌纤维化，利用生化方法测定心肌羟脯氨酸含量。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测心肌relaxin及其受体LGR7的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织relaxin的放免活性，用同位素标记的relaxin进行受体Binding实验，测定LGR7受体的亲和力。利用免疫组化及Western Blotd 方法检测α－平滑肌actin（α-SMA）的表达和组织分布；利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定I型及III型胶原蛋白的mRNA及蛋白表达、基质成分如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白－2及氨基葡聚糖等的表达、
心肌MMP-1、2、9、13、TIMPs-1的mRNA及蛋白表达，利用放射性同位素109Cd测定MMPs酶的活性。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测心肌AngII、醛固酮及其受体的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织AngII、醛固酮的放免活性，用受体Binding实验，测定AngII、醛固酮受体的亲和力。上述测定方法本课题组均熟练掌握。
2、确定relaxin的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。
分别以血管紧张素II、醛固酮处理的原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞为心肌纤维化模型，采用3H-胸腺嘧啶（TdR）入测定心肌成纤维细胞的增殖，免疫组化及Western Blotd 方法检测α－平滑肌actin（α-SMA）的表达和细胞定位说明成纤维细胞表型的改变，天狼星红染色观察心肌成纤维细胞胶原含量。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测心肌relaxin及其受体LGR7的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织relaxin的放免活性，用同位素标记的relaxin进行受体Binding实验，测定LGR7受体的亲和力。构建relaxin表达质粒，进行重组腺病毒的包装、克隆化、扩增、纯化和滴定测定后，转染乳鼠心肌细胞，造成relaxin高表达。利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定以确定的靶分子mRNA及蛋白表达，利用放射性同位素109Cd测定酶的活性。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测细胞AngII、醛固酮受体的mRNA表达，用受体Binding实验，测定AngII、醛固酮受体的亲和力。上述测定方法本课题组均熟练掌握。
3、确定relaxin抑制RAAS诱导心肌纤维化的分子靶点。
在AngII诱导的心肌纤维化组，利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定MAPK/ERK、原癌基因C-fos、活素蛋白AP-1、转化生长因子TGF－β的mRNA和蛋白表达，以同位素32P标记的γATP，放免测定或磷酸化的MAPK抗体进行Western Blot测定MAPK的活性，观察relaxin作用的分子靶点；在醛固酮诱导的心肌纤维化组，利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定AT1、AP-1、NF-ΚB、bFGF的mRNA和蛋白表达，并利用荧光染色共定位的方法测定NF-ΚB的转位，观察relaxin作用的分子靶点。上述测定方法本课题组均熟练掌握。
4、确定relaxin抑制心肌纤维化的信号转导机制。
根据以上研究，以relaxin作用的主要信号转导通路为切入点，如腺苷酸环化酶（adenyl cyclase,AC）、PKA、过酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase, PDE）、Erk1/2及PI3K/Akt，利用工具药（阻断剂和激动剂），并且直接采用酶学方法测定酶活性及Western Blot方法观察其表达、活化（磷酸化或去磷酸化），深入研究relaxin作用的信号转导机制。上述测定方法本课题组均熟练掌握。
可行性分析
Relaxin是迄今发现的最强的抗纤维化物质之一，对多种脏器如肝、肺、肾及皮肤的纤维化均有强大的抑制作用。本课题组的前期工作提示relaxin具有较强的心肌保护及抑制心肌纤维化的作用，但relaxin抗心肌纤维化的作用尚不清楚。本项目对relaxin抗心肌纤维化的机制及信号转导通路进行研究，确定内源性relaxin为机体内源性抗纤维化的防御体系是前期工作的深入和延续。本项目中采用的动物模型和刺激因素皆为国际通用的经典模型和药物，本课题组已熟练掌握构建质粒、基因重组及转染、RT-PCR、Northern Blot及Western Blot的技术和方法，并熟悉项目所涉及的生化指标测定和生理功能测定的方法和技术。
4．本项目的特色与创新之处
大量研究表明，Relaxin对皮肤、肝脏、肾脏及肺等多种组织器官具有显著的抗纤维化作用，我们前期工作也报道了relaxin改善ISO处理的大鼠心功能，抑制心肌纤维化，在国际杂志发表后引起了学术界的高度关注和评价，但有关relaxin抑制心肌纤维化的机制尚不清楚。与其他组织器官纤维化的发病不同，心肌纤维化与其自身的旁/自分泌活性物质AngII、醛固酮的功能紊乱关系更为密切，在多种因素诱导的心肌纤维化中都伴随心肌AngII、醛固酮基因表达和活性的增强，心脏内源性的relaxin系统是否通过对AngII、醛固酮的调节，实现抗心肌纤维化的作用，尚未见报道。通过此研究，我们将首次证实在心肌纤维化发展中，内源性relaxin系统的变化及relaxin对RAAS系统的影响及作用靶点，确定relaxin是机体内源性抗纤维化的防御体系，并确定relaxin抗心肌纤维化的分子信号转导通路。
5．年度研究计划及预期研究结果
2007.1－2007.8： 在ISO诱导的大鼠亚急性心衰及腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心衰模型上，观察心脏内源性的relaxin－1/3、LGR7表达的变化；研究外源性给予relaxin－1或relaxin－3后，心肌纤维化个指标的变化，以确定relaxin的抗心肌纤维化作用，并筛选其作用的靶分子。
2007.9－2008.12：在血管紧张素II、醛固酮诱导的原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞纤维化的模型上，观察心脏内源性的relaxin－1/3、LGR7表达的变化；研究构建表达relaxin的腺病毒，转染心肌成纤维细胞引起内源性的高表达relaxin，及分别予以relaxin－1或relaxin－3预处理后，心肌成纤维细胞的增殖及上述整体试验中初步确定的靶分子的表达和活性的变化，进一步确定relaxin的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。
2009.1－2009.12：在原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，分别利用relaxin作用的激动剂和拮抗剂，以上述试验中确定的靶分子的表达和活性的变化为指标，确定relaxin抑制心肌纤维化的信号转导机制。研究relaxin预处理后，AngII及醛固酮诱导心肌纤维化发生的分子信号的mRNA和蛋白表达及活性的变化，确定relaxin抑制RAAS诱导心肌纤维化的分子靶点。 预期结果：
通过上述研究，预计发表SCI 文章2-3篇，培养1-2名研究生。 （二）研究基础与工作条件 1. 工作基础
本课题组一直致力于内源性的心血管活性物质的心血管效应及其机制研究，并首先报道了尾加压素II、肾上腺髓质素、ghrelin及apelin等多种心血管旁自分泌物质在心血管疾病中的作用及可能机制。2003年始，我们室即开始关注relaxin的抗纤维化效应，并跟踪报道了国际上有关relaxin的重大事件，同时2005年，我们实验室首先在国外杂志上报道了relaxin在亚急性异丙肾上腺素 (Peptides，2005；26：1632-1639)诱导的大鼠心肌坏死、纤维化的模型上，心脏内源性的relaxin表达、合成增加，外源性给予relaxin可以明显改善心功能，减轻心肌缺血损伤，