发布时间 : 星期二 文章Western-Blot-原理和操作方法（全）更新完毕开始阅读ff38f1a5e109581b6bd97f19227916888486b99e
50 mmoL/L Tris( ph8.0)
二：1*loading Buffer样品缓冲液配置（1*SDS样品缓冲液） 50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0） 100 mmoL/L DTT(二硫苏糖醇) 2% SDS
0.1% 溴酚蓝 10% 甘油
此液可以配置成不同的储存液，根据蛋白浓度而定，40C长期保存，用时临时与蛋白液按比例混合，其中DTT应临时加入，以防降解。
蛋白质定量 1)Bradford法:
检测原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.
①Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放4℃至少6个月保持稳定.
②标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20μg -150μg/100μl之间绘制标准曲线.
③将待测样本溶于100μl缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用PBS) ④按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去.
⑤每个样品家5ml稀释的燃料结合溶液,作用5-30分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟. ⑥根据标准曲线计算待测样品的浓度.
2)Lowry法:
检测原理: 是Cu2+与蛋白作用生成的Cu+与双缩脲试剂形成兰色络合物,菲林试剂增强兰色形成,750nm检测.
①首先,将20g碳酸钠溶于500ml水中;再将1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸钠溶于500ml蒸馏水中;将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存1年以上.
②Folin-ciocalteu酚试剂
③按体积比1:2:1将铜/酒石酸/碳酸钠,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室温下储藏,可稳定保存2周,标明为试剂A
④按体积比1:5将Folin-ciocalteu酚试剂和H2O混合,室温下储存于琥珀色试剂瓶中,可稳定保存1个月,表明为时机B
⑤用蒸馏水将样本(5-100μg)稀释为1ml,并准备100,50,25,12.5μg /ml,4个浓度的BSA作为标准蛋白.
⑥每个蛋白样品家1.0ml试剂A,混合均匀,在室温下孵育10分钟. ⑦加入0.5 ml试剂B并立即混合, 在室温下孵育30分钟.
⑧在750nm光波长下测定吸光度;根据标准曲线计算样本蛋白质的浓度.
3)紫外分光光度法:
检测原理:是因蛋白质样品在280nm波长下有最大吸光率,最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在.
①纯化蛋白质浓度的测定:在280nm波长下读取与适当对照相比较的吸光值.
②对于抗体和BSA,可按照下述标准计算其浓度,对其他蛋白质粗略地估计:1单位吸光值相当于1mg/ml
蛋白质 A280(1mg/ml) IgG 1.35 IgM 1.2 BSA 0.7
③含有核苷酸的蛋白质溶液浓度的测定:
蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260) 蛋白质浓度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205)
1)SDS-PAGE设备和材料
①电泳装置（垂直板电泳槽）为北京六一仪器厂生产的DYCZ-24D型电泳装置。 ②电泳仪（电源）为北京六一仪器厂生产的DYY-8B型。 ③振荡器
2）试剂
①丙烯酰胺（电泳级）
②N,N′-甲叉双丙烯酰胺（bis） ③SDS ④TEMED ⑤Tris
⑥过硫酸铵
⑦α-巯基乙醇或DTT ⑧甘油 ⑨甘氨酸 ⑩溴酚蓝 11盐酸
3）聚胶前准备：
①配制凝胶储液： T%=30% C%=1% arc:bis=29:1 过滤后4℃避光保存。 ②配制浓缩胶缓冲液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 过滤后4℃避光保存。 ③配制分离胶缓冲液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 过滤后4℃避光保存。 ④配制10%SDS
⑤配制10%过硫酸铵（AP） ⑥TEMED原溶液 ⑦电泳缓冲液（5×）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,临用时稀释5倍至1×SDS电泳缓冲液加入电泳槽中。
4)制胶: 制胶关键是聚合时间,最好是分离胶聚合控制在分离胶从加入10%AP和TEMED起至开始出现凝胶的时间为15-20分钟（并不是此时已凝聚完全）。对浓缩胶最佳聚合速度
为8-10min开始可见聚合，可以通过调节AP和TEMED的加入量来控制，因液体中含有分子氧可抑制凝胶的聚合，故用时可在真空中抽气以排除液体中的分子氧，灌完分离胶后加水以封闭分离胶与外界氧气的结合，总之，要掌握一个原则：即用尽量少的催化剂在最佳时间聚合。
①按比例配制分离胶，轻缓地摇动溶液（8-10下），使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置90min。
②同前按比例配制浓缩胶，但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制90min以上以保证完全聚合。
5)预电泳： 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽电泳缓冲液后低电压短时间的预电泳（恒压10-20V,20-30min），清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。
6)加样： 预电泳后依次加入标准品和待分析样品，注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
7)电泳： 加样完毕，盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳，通常在连续系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶，电泳时，应采用恒压的模式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。
8）转膜：杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。 ① 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。
注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
② 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。
③装配转移三明治：海绵?3层滤纸?胶?膜?3层滤纸?海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），
加转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为 0.3A）。注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜
9)染色和脱色
电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣.对凝胶中分离成不同条带的蛋白进行检测.此外,根据不同的研究目的,也可将凝胶电印迹 ①考马斯亮蓝染色:
将凝胶取出放入培养皿中到如少量的染色液,以浸没凝胶为宜,在摇床上震荡,直到凝胶上出现明显的条带为止,一般5-6小时或者4℃过夜;然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡,其间要不断换脱色液,直至脱色液颜色稍清亮.,凝胶背景清楚为止. ②染色液配制:
90ml甲醇和H2O混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250用滤纸过滤染液以除去颗粒不溶性物质. ③脱色液的配制:
90mL(甲醇):H2O(1:1 V/V)和10ml冰乙酸溶液. 附：
一、蛋白标准品的选择
凝胶电泳中一个关键的指示系统，即蛋白标准品（Molecular Weight Marker），电泳的分离效率，转膜效率以及电泳泳动情况等，皆需通过蛋白标准品来显示，目前普遍采用的几种蛋白标准品有：
① Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix ② Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix
以上两种Marker均为PIERCE公司的产品，货号为：①prod# 26681; ②prod# 26691;该标准蛋白不需染色，在电泳凝胶中随着蛋白质的迁移，各种分子质量的标准蛋白逐渐分开，而显示出非常漂亮的多色条带，可通过电泳槽直接肉眼观察各电泳带的凝胶中的泳动情况，当相对于目的蛋白大小的标准蛋白与相邻两条标准蛋白达到所需分辨距离时，即可停止电泳，取出凝胶做进一步的转膜工作。
③ Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labled protein Molecular Weight Marker Mix
以上也为PIERCE产品，货号为：prod# 26651，该标准蛋白同上也具有以上作用外，同时在使用化学发光时，和样品一起显色经胶片曝光后，在胶片上可出现漂亮的条带。
④ Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix
以上为Sigma公司产品，货号为B2787,作用效果同③
二、对照的设置 一般需要设立:
内参照, 提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白
阳性对照, 即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量 阴性对照: 即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞.在实验中