发布时间 : 星期二 文章Western-Blot-原理和操作方法（全）更新完毕开始阅读ff38f1a5e109581b6bd97f19227916888486b99e
1．对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8%或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心，
2 大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此；转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为0.1%的SDS，以避免出现这种情况，甲醇易便SDS从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3 降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。 4 如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前PVDF需用甲醇活化。
5 选择湿式，4℃转膜过夜，以取代半干式转膜。 小蛋白（小于100 KD）
1 SDS妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加SDS。
2 保持20%的甲醇浓度，对于大于500KD的蛋白，请参考下述文献：Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide, gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 247, 185–192 (1997). 更多的转膜注意事项：
? 避免用直接接触膜，应使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑
? 排列三明治时，尽量用移液器或15ml试管赶除胶与膜之间的气泡，或将三明治放在装有的培养皿中以防止气泡产生，请戴手套！
? 确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否刚导致电流不能通过膜，从而转膜无效 ? 鸡抗体易于与PVDF膜和其它尼龙膜结合，导致高背景，请替换成硝酸纤维素膜以降低背景。
C-3 膜上蛋白的检测：丽春红
为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，
2%的丽春红贮备液(20ML)：: 2%丽春红(0.4克)溶于30%三氯乙酸(6克)和30%磺基水杨酸(6克)
丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液1：10稀释，即加9 倍的ddH2O 染色方法：
将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5分钟，大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，（膜也可以用TBST或水重新洗后再进行染色）PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。 10x TBS的配制 24.23 g Trizma HCl 80.06 g NaCl 加约 800 ml 超纯水 用纯HCl调pH 至7.6 定容至 1 L. TBST的配制
配制 1 L TBST：: 量取100 ml 10x TBS + 900超纯水 + 1ml Tween20
Tween20非常粘稠，用枪头不易吸取，请确定加入准确的量，最好用Tris buffer.配成10%的Tween20母液后使用。 常见问题分析与解决方案
问题 可能原因 验证或解决办法 延长封闭时间， 封闭不充分 更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等） 一抗浓度过高 抗体孵育温度过高 背景高 二抗非特异性结合 设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 或与封闭剂交叉反应 增加一抗稀释倍数, 4℃孵育 一抗或二抗与封闭剂有在孵育和洗涤液中加入Tween-20以减少交交叉反应 叉反应.
洗膜不充分 膜不合适 膜干燥 增加洗涤次数 NC膜比PVDF膜背景低 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 一抗、二抗等不匹配 订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性。 一抗或/和二抗浓度低 增加抗体浓度，延长孵育时间 封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20，或封闭剂与一抗或二抗有更换封闭剂（常用的脱脂奶、BSA、血清或明交叉反应 胶 一抗不识别目的物种的检查说明书，或做ClustalW比对，设阳性对靶蛋白 照 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白样本中无靶蛋白或靶蛋含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔白含量过低（抗原无效） 没有阳性条带 20-30ug蛋白,样本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目的蛋白。 或很弱 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,需正确的转膜操作,勿过度洗膜 转膜不充分,或洗膜过度 过度封闭 使用含0.5%脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液,或更换封闭剂,减少封闭时间 一抗失效 使用有效期内抗体,分装保存,避免反复冻融取用, 工作液现配现用 所用溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP的抑制剂) 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物,使用新鲜的底物. 二抗受叠氮钠抑制 酶和底物失效
曝光时间过短 延长曝光时间 细胞传代次数过多，使其使用原始或传代少的细胞株，或平行实验 蛋白表达模式的分化 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式：乙酰查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正化、磷酸化、甲基化、烷确的大小 基化、糖基化等 蛋白样本降解 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 多非特异性条新蛋白或同族蛋白的分查其它文献报导，或BLAST搜寻，使用说明带 享同种表位的不同剪接书报导的细胞株或组织 方式 或条带位置不对 一抗浓度过高 降低抗体浓度，可以减少非特异性条带 二抗浓度过高 产生非特异性结合 降低抗体浓度，增加二抗对照 选择特异性更强，只针对重链的二抗 使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带 SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10 min， 以增强蛋白质解聚变性 抗体未纯化 蛋白存在二聚体或多聚体 转膜时有气泡或抗体分尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动 布不均 背景有白色/黑色斑点 抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂 暗片现白条带 一抗或二抗加入过多 稀释抗体的浓度